सिंक्रोट्रॉन माइक्रो-सीटी के लिए हाई-थ्रूपुट कॉर्टिकल बोन सैंपल प्रोक्योरमेंट और एनालिसिस के लिए एक सेक्शनिंग, कोरिंग और इमेज प्रोसेसिंग गाइड
Summary
हमने मानव फेमोरा के पूर्वकाल पहलू से एसआरसीटी प्रयोगों के लिए समान आकार के कॉर्टिकल हड्डी नमूनों की खरीद के लिए एक भूवैज्ञानिक (स्कोरिंग) नमूना प्रोटोकॉल नियोजित किया। यह विधि न्यूनतम विनाशकारी, कुशल है, जिसके परिणामस्वरूप बेलनाकार नमूने होते हैं जो अनियमित नमूना आकार से इमेजिंग कलाकृतियों को कम करते हैं और माइक्रोआर्किटक्चुरल विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण में सुधार करते हैं।
Abstract
हड्डी एक गतिशील और यांत्रिक रूप से सक्रिय ऊतक है जो मानव जीवन काल में संरचना में परिवर्तन करता है। पारंपरिक दो आयामी तकनीकों का उपयोग करके हड्डी रीमॉडलिंग प्रक्रिया के उत्पादों का काफी अध्ययन किया गया है। डेस्कटॉप माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) और सिंक्रोट्रॉन विकिरण माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (SRμCT) के माध्यम से एक्स-रे इमेजिंग तकनीक में हाल की प्रगति ने अन्य 3डी इमेजिंग तकनीकों (जैसे, एसईएम) की तुलना में एक बड़े क्षेत्र (एफओवी) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी (3 डी) स्कैन के अधिग्रहण के लिए अनुमति दी है जो मानव कॉर्टिकल बोनिकल के भीतर माइक्रोस्कोपिक संरचनाओं की अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान करता है। नमूना सही FOV के भीतर केंद्रित किया जाना चाहिए, हालांकि, लकीर डेटा विश्लेषण को प्रभावित करने के लिए जाना जाता कलाकृतियों की उपस्थिति को सीमित करने के लिए । पिछले अध्ययनों ने अनियमित आकार के रेक्टिलियर बोन ब्लॉकों की खरीद की सूचना दी है जिसके परिणामस्वरूप असमान किनारों या छवि ट्रंकेशन के कारण इमेजिंग कलाकृतियों में परिणाम होता है। हमने मानव फेमोरा के पूर्वकाल पहलू से SRμCT प्रयोगों के लिए लगातार आकार के कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के लिए एक भूवैज्ञानिक नमूना प्रोटोकॉल (स्कोरिंग) लागू किया है। यह स्कोरिंग विधि ऊतक के लिए कुशल और न्यूनतम विनाशकारी है। यह एक समान बेलनाकार नमूने बनाता है जो रोटेशन के दौरान आइसोमेट्रिक होने की प्रकृति से इमेजिंग कलाकृतियों को कम करता है और स्कैनिंग के दौरान एक्स-रे बीम के लिए एक समान पथ लंबाई प्रदान करता है। कॉर्डिनेट और अनियमित आकार के नमूनों के एक्स-रे टोमोग्राफिक डेटा की छवि प्रसंस्करण कॉर्टिकल बोन माइक्रोआर्किटेचर के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण में सुधार करने के लिए तकनीक की क्षमता की पुष्टि करता है। इस प्रोटोकॉल का एक लक्ष्य कॉर्टिकल बोन कोर के निष्कर्षण के लिए एक विश्वसनीय और दोहराने योग्य विधि प्रदान करना है जो विभिन्न प्रकार के उच्च-रिज़ॉल्यूशन बोन इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलनीय है। काम का एक व्यापक लक्ष्य SRμCT के लिए एक मानकीकृत कॉर्टिकल बोन प्रोक्योरमेंट बनाना है जो सस्ती, सुसंगत और सीधा है। इस प्रक्रिया को संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं द्वारा आगे अनुकूलित किया जा सकता है जो आमतौर पर जैविक मानव विज्ञान, भूविज्ञान या भौतिक विज्ञान जैसे कठिन समग्र सामग्रियों का मूल्यांकन करते हैं।
Introduction
इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हाल ही में प्रगति के साथ, अब बहुत उच्च संकल्प के साथ एक्स-रे इमेजिंग डेटा प्राप्त करना संभव है। डेस्कटॉप माइक्रो-सीटी (μCT) सिस्टम उनके गैर विनाशकारी प्रकृति1के कारण रद्द हड्डी इमेजिंग के लिए वर्तमान मानक हैं । कॉर्टिकल हड्डी की माइक्रोस्ट्रक्चरल विशेषताओं को इमेजिंग करते समय, हालांकि, μCT का उपयोग अधिक सीमित किया गया है। संकल्प की बाधाओं के कारण, डेस्कटॉप सिस्टम कॉर्टिकल छिद्रों की तुलना में छोटे माइक्रोस्ट्रक्चरल सुविधाओं की छवि के लिए आवश्यक संकल्प प्राप्त नहीं कर सकते हैं, जैसे ऑस्टियोसाइट कमियां। इस आवेदन के लिए, एसआरसीटी इन प्रणालियों के अधिक से अधिक समाधान के कारण आदर्श है1। उदाहरण के लिए, बायोमेडिकल इमेजिंग एंड थेरेपी (बीएमआईटी) बीमलाइंस2 पर कनाडा के लाइट सोर्स (सील्स) में प्रयोगों ने 0.9 माइक्रोन के रूप में छोटे स्वरों के साथ छवियों का उत्पादन किया है। पिछले अध्ययन1,3, 4,5 ने इस संकल्प का उपयोग मानव लंबी हड्डियों(चित्र 1)से कॉर्टिकल हड्डी के नमूनों से अनुमानों और बाद के त्रि-आयामी (3 डी) प्राप्त करने के लिए किया है, जो ऑस्टियोसाइट कम्पत्य घनत्व4,6,7,8,9 और मानव जीवन के पार और सेक्स के बीच कम आकार और आकार3 में भिन्नता की मात्रा निर्धारित करता है। इसके अलावा के अध्ययनों ने मानव10में ऑस्टियोन बैंडिंग की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है, जो पहले फोरेंसिक मानवविज्ञान साहित्य में केवल अमानवीय स्तनधारियों के साथ जुड़े होने के लिए मान्यता प्राप्त है।
असाधारण संकल्प प्राप्त करने के लिए, एक्स-रे बीम को देखने के क्षेत्र (एफओवी) के भीतर बारीक ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए, जो अक्सर अधिकतम नमूना आकार को व्यास में कुछ मिलीमीटर तक सीमित करता है। वर्तमान में, इन प्रतिबंधों को पूरा करने वाली अस्थि नमूना खरीद की रूपरेखा वाले साहित्य में वर्णित कोई व्यापक, मानकीकृत प्रक्रियाएं नहीं की गई हैं । एफओवी के भीतर केंद्रित नमूने यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि 1) नमूना केंद्रित रहता है क्योंकि यह इमेजिंग के दौरान 180 डिग्री घूमता है, और 2) स्कैन कलाकृतियों सीमित हैं क्योंकि कोई छवि ट्रंकेशन नहीं है। दूसरे शब्दों में, FOV के बाहर नमूने का कोई हिस्सा एफओवी के अंदर अपने केंद्र बिंदु में प्रवेश करने वाली बीम में हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि ऐसा होता है, तो पुनर्निर्माण एल्गोरिदम पूरी तरह से सही पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक कुछ क्षीणन डेटा से वंचित है। यह आगे देखने लायक है कि 360 ° (पूर्ण रोटेशन) स्कैन बीम सख्त के प्रभाव को कम लेकिन इमेजिंग के दौरान गलत संरेखण और नमूना आंदोलन की वजह से कलाकृतियों में वृद्धि। इस प्रकार, जबकि एक 360 ° स्कैन आम तौर पर क्लीनर डेटा उत्पन्न करेगा, इमेजिंग समय दोगुना हो गया है और इसलिए प्रयोगात्मक लागत और डेटा की गुणवत्ता के बीच एक समझौता संबोधित किया जाना चाहिए।
हड्डी इमेजिंग प्रयोगों का एक महत्वपूर्ण और अक्सर अनदेखा पहलू स्कैनिंग से पहले किया गया सटीक और प्रतिकृति नमूना तैयारी तकनीक है। अध्ययन है कि उनके प्रयोगों में SRμCT तरीकों को शामिल संक्षेप में उनके नमूना प्रोटोकॉल का उल्लेख है, लेकिन लेखकों को विशेष पद्धति उनके नमूनों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल के बारे में कोई विस्तार करने के लिए थोड़ा प्रदान करते हैं । ऐसे कई अध्ययनों में मनमानेआयामों के रेक्टिलियर हड्डी ब्लॉक काटने का उल्लेख है, लेकिन आम तौर पर3,4,10, 11, 12, 13, 14का उपयोग किए जाने वाले उपकरणों या एम्बेडिंग सामग्रियोंकेबारे में कोई और जानकारी प्रदान नहीं की गई है। कुछ शोधकर्ता आमतौर पर ब्याज के क्षेत्र(आरओआई)3, 4, 10, 11, 12, 13,14से हड्डी के रेक्टिलियर ब्लॉकों को हटाने के लिए हैंडहेल्ड रोटरी टूल्स (जैसे,ड्रेमेल)का उपयोगकरतेहैं। इस विधि के परिणामस्वरूप गैर-गुणवत्ता वाले नमूने होते हैं जो एफओवी से बड़े हो सकते हैं, जिससे कलाकृतियों और छवि ट्रंकेशन को स्कैन करने की संभावना बढ़ जाती है। इस तरह के नमूनों को अक्सर सटीक डायमंड-वेफर आरी (जैसे, बुहलर आइसोमेट) का उपयोग करके और अधिक परिष्कृत करने की आवश्यकता होती है। लगातार आयामों (दो-सौवें/मिमी तक) के साथ नमूनों की खरीद यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि अधिग्रहीत डेटासेट उच्चतम गुणवत्ता के हैं और बाद के परिणाम प्रतिकृति हैं ।
नमूना खरीद पद्धति की सीमित रिपोर्टिंग में पिछले अध्ययन में किए गए तरीकों को नियोजित करने और/या मान्य करने का प्रयास करते समय कठिनाई की एक अतिरिक्त परत जोड़ती है । वर्तमान में, शोधकर्ताओं ने अपने नमूना प्रक्रियाओं पर अधिक जानकारी के लिए सीधे लेखकों से संपर्क करना चाहिए । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बायोमेडिकल शोधकर्ताओं को अच्छी तरह से प्रलेखित, प्रतिकृति और लागत-कुशल नमूना तकनीक प्रदान करता है। इस लेख का प्राथमिक उद्देश्य माइक्रोआर्किटक्चुअल डेटा के सटीक दृश्य और निष्कर्षण के लिए मिल-ड्रिल प्रेस और डायमंड स्कोरिंग बिट का उपयोग करके लगातार आकार के कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के बारे में एक व्यापक ट्यूटोरियल प्रदान करना है। इस विधि को नियमित रूप से उच्च दबाव वाले रॉक यांत्रिकी 15, 16, 17,18,19 में कठोर सामग्रियों के ब्लॉक से एकसमान,छोटे व्यास(1-5मिमी)सिलेंडर एकत्र करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं से संशोधित कियाजाताहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीमित एफवीओ सेटअप के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसआरसीटी इमेजिंग के लिए यूनिफॉर्म और बेलनाकार कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के लिए कोई व्यापक, मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं किया गया है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पेपर में वर्णित शोध कनाडा के लाइट सोर्स में BMIT सुविधा में किया गया था, जिसे कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा, साकटचेवान विश्वविद्यालय, साकटचेवान सरकार, वेस्टर्न इकोनॉमिक डाइवर्सिफिकेशन कनाडा, नेशनल रिसर्च काउंसिल कनाडा और कनाडा के इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ रिसर्च द्वारा समर्थित किया जाता है । लेखक कनाडा के प्रकाश स्रोत, विशेष रूप से एडम वेब, डेनिस मिलर, सेर्गेई गैसिलोव, और निंग ज़ू में स्काईस्कैन SRμCT और सफेद बीम माइक्रोस्कोप सिस्टम के सेट-अप और समस्या निवारण में सहायता के लिए बीमलाइन वैज्ञानिकों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम इस अध्ययन के लिए कैडेड्रिक नमूनों तक पहुंच के लिए टोलेडो कॉलेज ऑफ मेडिसिन एंड लाइफ साइंसेज और पूर्वोत्तर ओहियो मेडिकल यूनिवर्सिटी के डॉ जेफरी वेनस्ट्रप से बेथ डालजेल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं । जेएम एंड्रोनोवस्की को एक्रोन विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्ट-अप अनुसंधान कोषों और आपराधिक न्याय उद्देश्य अनुदान (2018-डीयू-बीएक्स-0188) के लिए फोरेंसिक विज्ञान में एक राष्ट्रीय न्याय अनुसंधान और विकास संस्थान द्वारा प्रदान किया जाता है। आरए डेविस को एक स्नातक सहायक द्वारा समर्थित किया जाता है जो एक्रोन विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया जाता है। स्कोरिंग और सॉइंग के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण और आपूर्ति को यूनिवर्सिटी ऑफ एक्रोन और एनएसएफ ग्रांट इयर-1624242 द्वारा सीडब्ल्यू होलीओक को प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंडों द्वारा खरीदा गया था।
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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