高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド
Summary
ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。
Abstract
骨は、人間の寿命にわたって構造を変化させる動的で機械的に活性な組織です。骨のリモデリングプロセスの産物は、従来の二次元技術を用いて実質的に研究されてきた。デスクトップマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)およびシンクロトロン放射微小断層撮影(SRμCT)によるX線イメージング技術の最近の進歩により、他の3Dイメージング技術(例えば、SEM)よりも大きな視野(FOV)の高解像度3次元(3D)スキャンを取得することができました。ただし、データ分析に影響を与えるストリークアーティファクトの外観を制限するために、標本はFOV内で正確に中心に配置する必要があります。これまでの研究では、不規則な形状の直線的な骨ブロックの調達が報告され、エッジの不均一や画像切り捨てによるイメージングアーティファクトが発生しています。ヒトの女性の前側面からSRμCT実験用に一貫して大きさの皮質骨コア標本を調達するために、地質サンプリングプロトコル(スコア)を適用しました。このスコアリング方法は、効率的で、組織に対して最小限の破壊です。回転中に等角体であること、および走査中のX線ビームに均一なパス長を提供する性質によって、イメージングアーティファクトを減少させる均一な円筒形サンプルを作成します。X線の断層データの成形および不規則な形状のサンプルの画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する技術の可能性を確認する。このプロトコルの目標は、さまざまなタイプの高解像度骨イメージング実験に適応可能な皮質骨コアの抽出のための信頼性と再現性のある方法を提供することです。この作業の包括的な目標は、手頃な価格で一貫性があり、簡単なSRμCTの標準化された皮質骨調達を作成することです。この手順は、生物人類学、地球科学、材料科学などの硬質複合材料を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応され得る。
Introduction
近年のイメージング技術の進歩により、非常に高い解像度でX線イメージングデータを取得することが可能になりました。デスクトップマイクロCT(μCT)システムは、非破壊性の性質に起因する、消光骨を撮像するための現在の標準である1.しかし、皮質骨の微細構造特徴をイメージングする場合、μCTの使用はより限定的であった。解像度の制約により、デスクトップシステムは、骨細胞ラクナエのような皮質毛穴よりも小さい微細構造特徴を画像化するために必要な解像度を達成できません。このアプリケーションでは、SRμCTは、これらのシステムの解像度が高いため理想的です1.例えば、バイオメディカルイメージングおよび治療(BMIT)ビームライン2のカナダ光源(CLS)での実験では、ボクセルが0.9μmの小さな画像を生成しています。これまでの研究1、3、4、5は、この解像度を使用して、人間の長い骨(図1)からの皮質骨標本から投影とその後の3次元(3D)レンダリングを取得し、骨細胞ラクナー密度4、6、7、8、9およびヒトの寿命と男女間のラクナ形状とサイズ3の変動を定量化した。 さらなる研究は、ヒト10における骨バンディングの存在を実証しており、法医学人類学的文献において非ヒト哺乳類のみに関連付けられていると以前に認識されていた現象である。
例外的な解像度を達成するためには、X線ビームは、多くの場合、直径数ミリメートルに最大標本サイズを制限する視野(FOV)内に細かく焦点を合わせる必要があります。現在、これらの制限を満たす骨サンプル調達を概説する文献に記載されている包括的で標準化された手順はありません。FOV内のセンタリング標本は、1)イメージング中に180°回転する際にサンプルの中心を維持し、2)スキャンアーティファクトが画像切り捨てがないため制限されていることを確認するために重要です。つまり、FOVの外側のサンプルの部分は、FOV内の焦点に入るビームを妨げない。この場合、再構築アルゴリズムは完全に正しい再構築に必要な減衰データの一部を奪われます。360°(フル回転)スキャンはビーム硬化の影響を最小限に抑えますが、イメージング中の不整列やサンプルの動きによって引き起こされるアーティファクトを増加させることは注目に値します。したがって、360°スキャンは通常よりクリーンなデータを生成しますが、イメージング時間は2倍になり、実験コストとデータ品質の妥協に対処する必要があります。
骨イメージング実験の重要で見過ごされがちな側面は、スキャン前に行われる正確で複製可能な検体調製技術です。SRμCT法を実験に組み込んだ研究では、サンプリングプロトコルについて簡単に言及しているが、著者らは標本を収集するために使用される特定の方法論についてほとんどまたは全く詳細を提供していない。このような研究の多くは、任意の次元の直線的な骨ブロックを切断することを言及しているが、一般的に使用されるツールや埋め込み材料に関するそれ以上の情報を提供しない3,4,10, 11,12,13,14.一部の研究者は、一般的に、関心領域から骨の直線ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えば、Dremel)を使用しています (ROI)3,4,10,11,12,13,14.この方法では、FOV より大きいサイズの不均等なサンプルが得られ、スキャンアーティファクトや画像切り捨ての可能性が高くなります。このような標本は、多くの場合、精密ダイヤモンドウェハソー(例えば、ビューラー異性体)を使用して、さらなる精製を必要とする。(200/mmまで)一貫した次元でサンプルを調達することは、取得したデータセットが最高品質で、その後の結果が複製可能であることを保証するために重要です。
サンプル調達方法論の限定的な報告は、以前の調査で実行された方法を採用および検証しようとする際に、困難の余分な層を追加します。現在、研究者は、サンプリング手順の詳細については、著者に直接連絡する必要があります。ここで詳述するプロトコルは、生物医学研究者に、徹底的に文書化され、複製可能で、コスト効率の高いサンプリング技術を提供します。この記事の主な目的は、マイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出のためにミルドリルプレスとダイヤモンドのスコアリングビットを使用して、一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。この方法は、高圧岩力学15、16、17、18、19の硬質材料のブロックから均一な、小径(1-5ミリメートル)のシリンダーを日常的に収集するために使用される手順から変更されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
限られたFOVセットアップで高解像度のSRμCTイメージング用の均一および円筒形皮質骨コアサンプルを調達するための包括的で標準化されたプロトコルはありませんでした。ここで詳述するプロトコルは、SRμCTイメージングのための一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法と、その後のマイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出に関する包括的なチュートリアルを提供?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この論文に記載されている研究は、カナダイノベーション自然科学工学研究評議会、サスカチュワン大学、サスカチュワン州政府、カナダ西部経済多様化カナダ、カナダ国立研究評議会、カナダ保健研究所の支援を受けたカナダ光源のBMIT施設で行われました。著者らは、カナダ光源、特にアダム・ウェッブ、デニス・ミラー、セルゲイ・ガシロフ、寧ズーのビームライン科学者に、SkyScan SRμCTと白いビーム顕微鏡システムのセットアップとトラブルシューティングに協力してくれたことに感謝したいと考えています。また、トレド医科生命科学大学のベス・ダルツェルと、オハイオ州北東部医科大学のジェフリー・ウェンストルップ博士に感謝したいと考えています。JMアンドロノフスキは、アクロン大学と国立司法科学法医学研究所が提供するスタートアップ研究資金(2018-DU-BX-0188)を通じて支援されています。RAデイビスは、アクロン大学が提供する大学院助手によってサポートされています。採点および鋸で使用される装置および供給は、アクロン大学とNSFが、CW HolyokeにEAR-1624242を交付するスタートアップ資金によって購入された。
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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