En snittings-, kordings- og bildebehandlingsveiledning for kortikale beinprøveinnkjøp og -analyse for Synchrotron Micro-CT
Summary
Vi brukte en geologisk (coring) prøvetakingsprotokoll for å skaffe kortikale beinprøver av ensartet størrelse for SRμCT-eksperimenter fra det fremre aspektet av menneskelig femora. Denne metoden er minimalt ødeleggende, effektiv, resulterer i sylindriske prøver som minimerer bildeartefakter fra uregelmessige prøveformer og forbedrer mikroarkitektitectural visualisering og analyse.
Abstract
Bone er et dynamisk og mekanisk aktivt vev som endres i struktur over menneskets levetid. Produktene i bengjemodelingsprosessen har blitt studert betydelig ved hjelp av tradisjonelle todimensjonale teknikker. Nylige fremskritt innen røntgenbildeteknologi via mikrodatatomografi (μCT) og synchrotron stråling mikro-computertomografi (SRμCT) har tillatt for oppkjøp av høyoppløselige tredimensjonale (3D) skanninger av et større synsfelt (FOV) enn andre 3D-bildeteknikker (f.eks. SEM) som gir et mer komplett bilde av mikroskopiske strukturer innenfor menneskelig kortikale bein. Prøven bør imidlertid være nøyaktig sentrert i FOV for å begrense utseendet på strekartefakter som er kjent for å påvirke dataanalyse. Tidligere studier har rapportert innkjøp av uregelmessig formede rettlinjede beinblokker som resulterer i bildeartefakter på grunn av ujevne kanter eller bildeavkorting. Vi har brukt en geologisk prøvetakingsprotokoll (coring) for å skaffe konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver for SRμCT-eksperimenter fra det fremre aspektet av menneskelig femora. Denne coring metoden er effektiv og minimalt ødeleggende for vev. Det skaper ensartede sylindriske prøver som reduserer bildeartefakter av natur å være isometrisk under rotasjon og gir en jevn banelengde for røntgenstråler gjennom skanning. Bildebehandling av røntgentomografiske data av korterte og uregelmessig formede prøver bekrefter potensialet i teknikken for å forbedre visualisering og analyse av kortikale beinmikroarkitektur. Et mål med denne protokollen er å levere en pålitelig og repeterbar metode for utvinning av kortikale beinkjerner som kan tilpasses for ulike typer høyoppløselige beinavbildningseksperimenter. Et overordnet mål med arbeidet er å skape en standardisert kortikale beinanskaffelser for SRμCT som er rimelig, konsekvent og grei. Denne prosedyren kan videre tilpasses av forskere på beslektede felt som ofte evaluerer harde komposittmaterialer som i biologisk antropologi, geovitenskap eller materialvitenskap.
Introduction
Med nylige fremskritt innen bildeteknologi er det nå mulig å skaffe røntgenbildedata med svært høy oppløsning. Stasjonære mikro-CT-systemer (μCT) er gjeldende standard for avbildning av avredust bein på grunn av deres ikke-destruktive natur1. Ved avbildning av mikrostrukturelle trekk ved kortikal bein har imidlertid μCT-bruk vært mer begrenset. På grunn av oppløsningsbegrensninger kan ikke skrivebordssystemer oppnå oppløsningen som kreves for å bilde mikrostrukturelle funksjoner som er mindre enn kortikale porer, for eksempel osteocyttlakuna. For dette programmet er SRμCT ideell på grunn av større oppløsning av disse systemene1. For eksempel har eksperimenter ved canadian Light Source (CLS) på BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) strålelinjer2 produsert bilder med voxels så små som 0,9 μm. Tidligere studier1,3,4,5 har brukt denne oppløsningen til å skaffe projeksjoner og påfølgende tredimensjonale (3D) gjengir fra kortikale beinprøver fra menneskelige lange bein ( figur1) for å kvantifisere osteocyttlakunar tetthet4,6,7,8,9 ogvariasjon i lacunar form ogstørrelse 3 over den menneskelige levetid og mellom kjønnene. Videre studier har vist tilstedeværelsen av osteonbanding hos mennesker10, et fenomen som tidligere er anerkjent for å være forbundet med bare ikke-menneskelige pattedyr i rettsmedisinsk antropologisk litteratur.
For å oppnå eksepsjonell oppløsning må røntgenstrålen være fint fokusert innen synsfeltet (FOV), som ofte begrenser den maksimale prøvestørrelsen til noen få millimeter i diameter. For tiden har det ikke vært noen omfattende, standardiserte prosedyrer beskrevet i litteraturen som beskriver beinprøveanskaffelser som oppfyller disse restriksjonene. Sentreringsprøver i FOV er avgjørende for å sikre at 1) prøven forblir sentrert når den roterer 180° under bildebehandling, og 2) skanneartefakter er begrenset siden det ikke er noen bildeavkorting. Med andre ord, ingen deler av prøven utenfor FOV forstyrrer strålen som kommer inn i fokuspunktet inne i FOV. Hvis dette skjer, er rekonstruksjonsalgoritmen fratatt noen av dempingsdataene som trengs for en fullstendig korrekt rekonstruksjon. Det er videre verdt å notere at 360° (full rotasjon) skanner minimere effekten av stråleherding, men øke artefakter forårsaket av feiljustering og prøvebevegelse under avbildning. Dermed, mens en 360° skanning vanligvis vil generere renere data, er bildetiden doblet og derfor må et kompromiss mellom eksperimentell kostnad og datakvalitet tas opp.
Et viktig og ofte oversett aspekt ved beinbildeeksperimenter er den nøyaktige og replikerbare prøveforberedelsesteknikken som utføres før skanning. Studier som inkorporerer SRμCT-metoder i sine eksperimenter nevner kort deres prøvetakingsprotokoll, men forfatterne gir liten eller ingen detaljer om den spesielle metodikken som brukes til å samle sine prøver. Mange slike studier nevner kutte rettlinjede bein blokker av vilkårlige dimensjoner, men generelt gir ingen ytterligere informasjon om verktøy eller innebygging materialer sombrukes 3,4,10,11,12,13,14. Noen forskere bruker vanligvis håndholdte roterende verktøy (f.eks Dremel) for å fjerne rettlinjede benblokker fra et område av interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Denne metoden resulterer i prøver av ikke-uniform størrelse som kan være større enn FOV, noe som øker sannsynligheten for skanneartefakter og bildeavkorting. Slike prøver krever ofte ytterligere raffinering ved hjelp av en presisjon diamant-wafer sag (f.eks Buehler Isomet). Anskaffe prøver med konsistente dimensjoner (til to hundredeler /mm) er avgjørende for å sikre at de anskaffede datasettene er av høyeste kvalitet, og de påfølgende resultatene replikeres.
Den begrensede rapporteringen av eksempelinnkjøpsmetodikk legger til et ekstra vanskelighetslag når du prøver å bruke og/eller validere metoder som utføres i en tidligere studie. For tiden må forskere kontakte forfattere direkte for ytterligere detaljer om sine prøvetakingsprosedyrer. Protokollen som er beskrevet her gir biomedisinske forskere en grundig dokumentert, replikerbar og kostnadseffektiv prøvetakingsteknikk. Hovedmålet med denne artikkelen er å gi en omfattende veiledning om hvordan du anskaffer konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver ved hjelp av en mill-drill trykk og diamant coring bit for nøyaktig visualisering og utvinning av mikroarkitektitectural data. Denne metoden er modifisert fra prosedyrer som brukes til rutinemessig å samle uniform, liten diameter (1-5 mm) sylindere fra blokker av harde materialer i høytrykks rock mekanikk15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har ikke vært noen omfattende, standardisert protokoll for anskaffe ensartet og sylindrisk kortikale beinkjerneprøver for høyoppløselig SRμCT-avbildning med begrensede FOV-oppsett. Protokollen som er beskrevet her fyller det ugyldige ved å gi en omfattende veiledning om hvordan du anskaffer konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver for SRμCT-bildebehandling og påfølgende nøyaktig visualisering og ekstraksjon av mikroarkitektitectural data. Vi har vist at vår protokoll gir en mer standardisert og p?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning beskrevet i denne artikkelen ble utført ved BMIT-anlegget ved canadian Light Source, som støttes av Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, regjeringen i Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada og Canadian Institutes of Health Research. Forfatterne vil gjerne takke strålelinjeforskerne ved den kanadiske lyskilden, spesielt Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov og Ning Zu for hjelpen i oppsett og feilsøking av SkyScan SRμCT og hvitstrålemikroskopsystemer. Vi ønsker også å takke Beth Dalzell fra The University of Toledo College of Medicine and Life Sciences og Dr. Jeffrey Wenstrup fra Northeast Ohio Medical University for tilgang til kadaveriske prøver for denne studien. JM Andronowski støttes gjennom oppstartsforskningsmidler levert av The University of Akron og national Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes grant (2018-DU-BX-0188). RA Davis støttes av et graduate assistantship levert av The University of Akron. Utstyr og forsyninger som brukes til coring og saging ble kjøpt ved oppstartsmidler levert av The University of Akron og NSF gi EAR-1624242 til CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
