Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron
Summary
Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.
Abstract
O osso é um tecido dinâmico e mecanicamente ativo que muda de estrutura ao longo da vida humana. Os produtos do processo de remodelação óssea foram estudados substancialmente utilizando técnicas bidimensionais tradicionais. Os recentes avanços na tecnologia de imagem de raios-X por meio da tomografia microcomputante de desktop (μCT) e da tomografia microcomputante de radiação síncrotron (SRμCT) permitiram a aquisição de varreduras tridimensionais de alta resolução (3D) de um campo de visão maior (FOV) do que outras técnicas de imagem 3D (por exemplo, SEM) fornecendo uma imagem mais completa de estruturas microscópicas dentro do osso cortical humano. A amostra deve ser centrada com precisão dentro do FOV, no entanto, para limitar o aparecimento de artefatos de raia conhecidos por impactar a análise de dados. Estudos anteriores relataram a aquisição de blocos ósseos retilineares de forma irregular que resultam em artefatos de imagem devido a bordas irregulares ou truncação de imagem. Aplicamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método de coring é eficiente e minimamente destrutivo para o tecido. Ele cria amostras cilíndricas uniformes que diminuem artefatos de imagem por natureza de ser isométrico durante a rotação e fornecendo um comprimento de caminho uniforme para raios-X durante a varredura. O processamento de imagens de dados tomográficos de raios-X de amostras cored e de forma irregular confirma o potencial da técnica para melhorar a visualização e análise da microarquitetura óssea cortical. Um objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável e repetível para a extração de núcleos ósseos corticais que são adaptáveis para vários tipos de experimentos de imagem óssea de alta resolução. Um objetivo abrangente do trabalho é criar uma aquisição padronizada de ossos cortical para SRμCT que seja acessível, consistente e simples. Esse procedimento pode ser adaptado ainda por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam materiais compostos duros, como na antropologia biológica, geociências ou ciências materiais.
Introduction
Com os recentes avanços na tecnologia de imagem, agora é viável adquirir dados de imagem de raios-X com resolução muito alta. Os sistemas de microcC (μCT) da área de trabalho são o padrão atual para imagens de osso cancelado devido à sua natureza não destrutiva1. Quando as características microestruturais de imagem do osso cortical, no entanto, o uso de μCT tem sido mais limitado. Devido a restrições de resolução, os sistemas de desktop não podem atingir a resolução necessária para a imagem de recursos microestruturais menores que os poros corticais, como a lacuna de osteociato. Para esta aplicação, o SRμCT é ideal devido à maior resolução desses sistemas1. Por exemplo, experimentos na Canadian Light Source (CLS) nas linhas de luz biomédicas de imagem e terapia2 produziram imagens com voxels de até 0,9 μm. Estudos anteriores1,3,4,5 utilizaram esta resolução para adquirir projeções e renderizações tridimensionais subsequentes (3D) de amostras de ossos cortical de ossos longos humanos(Figura 1) para quantificar a densidade do osteocito lacunar4,6,7,8,9 e variação na forma e tamanho3 em toda a vida humana e entre os sexos. Outros estudos demonstraram a presença de banda de osteon em humanos10, fenômeno anteriormente reconhecido como associado apenas a mamíferos não humanos na literatura antropológica forense.
Para alcançar uma resolução excepcional, o feixe de raios-X deve estar bem focado dentro do campo de visão (FOV), que muitas vezes limita o tamanho máximo da amostra a alguns milímetros de diâmetro. Atualmente, não há procedimentos abrangentes e padronizados descritos na literatura delineando a aquisição de amostras ósseas que atendam a essas restrições. O centro de amostras dentro do FOV é fundamental para garantir que 1) a amostra permaneça centrada à medida que gira 180° durante a imagem, e 2) artefatos de varredura sejam limitados, uma vez que não há truncação de imagem. Em outras palavras, nenhuma porção da amostra fora do FOV interfere com o feixe entrando em seu ponto focal dentro do FOV. Se isso ocorrer, o algoritmo de reconstrução é privado de alguns dos dados de atenuação necessários para uma reconstrução totalmente correta. Vale ressaltar ainda que os escaneamentos de 360° (rotação total) minimizam os efeitos do endurecimento do feixe, mas aumentam os artefatos causados pelo desalinhamento e movimento da amostra durante a imagem. Assim, enquanto uma varredura de 360° normalmente gera dados mais limpos, o tempo de imagem é dobrado e, portanto, um compromisso entre custo experimental e qualidade de dados deve ser abordado.
Um aspecto importante e muitas vezes negligenciado dos experimentos de imagem óssea é a técnica precisa e replicável de preparação de amostras realizada antes da varredura. Estudos que incorporam métodos SRμCT em seus experimentos mencionam brevemente seu protocolo amostral, mas os autores fornecem pouco ou nenhum detalhe sobre a metodologia específica usada para coletar seus espécimes. Muitos desses estudos mencionam o corte de blocos ósseos retilícleos de dimensões arbitrárias, mas geralmente não fornecem mais informações sobre as ferramentas ou materiais de incorporação utilizados3,4,10,11,12,13,14. Alguns pesquisadores geralmente usam ferramentas rotativas portáteis (por exemplo, Dremel) para remover blocos retilineares do osso de uma região de interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método resulta em amostras de tamanho não uniforme que podem ser maiores que o FOV, aumentando a probabilidade de artefatos de varredura e truncação de imagem. Tais espécimes muitas vezes requerem mais refinação usando uma serra de bola de diamante de precisão (por exemplo, Buehler Isomet). A aquisição de amostras com dimensões consistentes (até os dois centésimos/mm) é fundamental para garantir que os conjuntos de dados adquiridos sejam da mais alta qualidade e os resultados subsequentes sejam replicáveis.
O relatório limitado da metodologia de aquisição de amostras adiciona uma camada extra de dificuldade ao tentar empregar e/ou validar métodos realizados em um estudo anterior. Atualmente, os pesquisadores devem entrar em contato diretamente com os autores para obter mais detalhes sobre seus procedimentos de amostragem. O protocolo aqui detalhado fornece aos pesquisadores biomédicos uma técnica de amostragem completamente documentada, replicável e econômica. O objetivo principal deste artigo é fornecer um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente usando uma prensa de perfuração de moinho e coring de diamante para a visualização precisa e extração de dados microarquitecturais. Este método é modificado a partir de procedimentos utilizados para coletar rotineiramente cilindros uniformes de pequeno diâmetro (1-5 mm) de blocos de materiais duros em mecânica de rocha de alta pressão15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Não houve nenhum protocolo abrangente e padronizado para a aquisição de amostras de núcleo ósseo cortical uniforme e cilíndrico para imagens SRμCT de alta resolução com configurações fov limitadas. O protocolo aqui detalhado preenche esse vazio fornecendo um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para imagens SRμCT e a visualização e extração precisa subsequente de dados microarquiteturais. Mostramos que nosso protocolo fornece um método mais padro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa descrita neste artigo foi realizada na instalação do BMIT na Canadian Light Source, que é apoiada pela Fundação canadense para Inovação, Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá, universidade de Saskatchewan, governo de Saskatchewan, Diversificação Econômica Ocidental do Canadá, Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer aos cientistas de linha de luz canadenses na Canadian Light Source, particularmente Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu pela assistência na configuração e solução de problemas dos sistemas de microscópio SkyScan SRμCT e feixe branco. Também queremos agradecer a Beth Dalzell, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida da Universidade de Toledo, e ao Dr. Jeffrey Wenstrup, da Universidade Médica do Nordeste de Ohio, pelo acesso a amostras cadavéricas para este estudo. JM Andronowski é apoiado por meio de fundos de pesquisa de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e uma bolsa do Instituto Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Justiça em Ciência Forense para Fins de Justiça Criminal (2018-DU-BX-0188). RA Davis é apoiado por uma assistente de pós-graduação fornecida pela Universidade de Akron. Equipamentos e suprimentos utilizados para coring e serragem foram comprados por fundos de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e NSF concedem EAR-1624242 à CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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