En sektions-, coring- och bildbehandlingsguide för hög genomströmning När benprovanskaffning och analys för synkrotronmikrotron micro-CT
Summary
Vi använde ett geologiskt (coring) provtagning protokoll för att skaffa när ben exemplar av enhetlig storlek för SRμCT experiment från den främre aspekten av mänskliga femora. Denna metod är minimalt destruktiv, effektiv, resulterar i cylindriska exemplar som minimerar bildartefakter från oregelbundna provformer och förbättrar mikroarchitectural visualisering och analys.
Abstract
Ben är en dynamisk och mekaniskt aktiv vävnad som förändras i struktur under människans livslängd. Produkterna från benrenoveringsprocessen har studerats väsentligt med hjälp av traditionella tvådimensionella tekniker. De senaste framstegen inom röntgenavbildningsteknik via stationär mikrodatortomografi (μCT) och synkrotronstrålning mikrodatortomografi (SRμCT) har gjort det möjligt att förvärva högupplösta tredimensionella (3D) skanningar av ett större synfält (FOV) än andra 3D-bildtekniker (t.ex. SEM) som ger en mer komplett bild av mikroskopiska strukturer inom humant kortben. Provet bör dock vara noggrant centrerat inom FOV för att begränsa utseendet på streak artefakter som är kända för att påverka dataanalys. Tidigare studier har rapporterat upphandling av oregelbundet formade rätlinjiga benblock som resulterar i bild artefakter på grund av ojämna kanter eller bild trunkering. Vi har tillämpat ett geologiskt provtagningsprotokoll (coring) för att skaffa konsekvent stora när benkärnprover för SRμCT experiment från den främre aspekten av mänskliga femora. Denna coring metod är effektiv och minimalt destruktiv för vävnad. Det skapar enhetliga cylindriska prover som minskar avbildningsartefakter genom att vara isometriska under rotation och ge en enhetlig banlängd för röntgenstrålar under hela skanningen. Bildbehandling av röntgentomografiska data av cored och oregelbundet formade prover bekräftar teknikens potential att förbättra visualisering och analys av när ben microarchitecture. Ett mål med detta protokoll är att leverera en tillförlitlig och repeterbar metod för extraktion av när benkärnor som kan anpassas för olika typer av högupplösta benavbildningsexperiment. Ett övergripande mål med arbetet är att skapa en standardiserad kortikal benanskaffning för SRμCT som är prisvärd, konsekvent och enkel. Detta förfarande kan vidare anpassas av forskare inom relaterade områden som vanligtvis utvärderar hårda sammansatta material som i biologisk antropologi, geovetenskap eller materialvetenskap.
Introduction
Med de senaste framstegen inom bildteknik är det nu möjligt att förvärva röntgenbilder med mycket hög upplösning. Stationära mikro-CT-system (μCT) är den aktuella standarden för avbildning av annullerande ben på grund av deras icke-destruktiva natur1. Vid avbildning av mikrostrukturella egenskaper hos närben har dock μCT-användningen varit mer begränsad. På grund av upplösningsbegränsningar kan stationära system inte uppnå den upplösning som krävs för att avbilda mikrostructurala funktioner som är mindre än när porer, såsom osteocyt-luckor. För denna applikation är SRμCT idealisk på grund av den högre upplösningen av dessa system1. Till exempel har experiment vid Canadian Light Source (CLS) på BMIT-strållinjerna (BioMedical Imaging and Therapy)2 producerat bilder med voxels så små som 0,9 μm. Tidigare studier1,3,4,5 har använt denna upplösning för att förvärva projektioner och efterföljande tredimensionella (3D) renderingar från närbensprover från mänskliga långa ben ( Figur1) för att kvantifiera osteocyt lacunar densitet4,6,7,8,9 och variation i lacunar form och storlek3 över människans livslängd och mellan könen. Ytterligare studier har visat förekomsten av osteonbanding hos människor10, ett fenomen som tidigare erkänts vara associerat med endast icke-mänskliga däggdjur i den rättsmedicinska antropologiska litteraturen.
För att uppnå exceptionell upplösning måste röntgenstrålen vara fint fokuserad inom synfältet (FOV), som ofta begränsar den maximala provstorleken till några millimeter i diameter. För närvarande har det inte funnits några omfattande, standardiserade förfaranden som beskrivs i litteraturen som beskriver benprovsupphandling som uppfyller dessa begränsningar. Centreringsprover i FOV är avgörande för att säkerställa att 1) provet förblir centrerat när det roterar 180° under avbildning, och 2) skanningsartefakter är begränsade eftersom det inte finns någon bild trunkering. Med andra ord stör inga delar av provet utanför FOV strålen som kommer in i dess brännpunkt inuti FOV. Om detta inträffar berövas rekonstruktionsalgoritmen några av de dämpningsdata som behövs för en helt korrekt rekonstruktion. Det är vidare värt att notera att 360° (full rotation) skanningar minimerar effekterna av strålhärdning men ökar artefakter som orsakas av feljustering och provrörelse under avbildning. Således, medan en 360 ° skanning vanligtvis kommer att generera renare data, fördubblas bildtiden och därför måste en kompromiss mellan experimentell kostnad och datakvalitet åtgärdas.
En viktig och ofta förbisedd aspekt av ben imaging experiment är den exakta och reproducerbara prov förberedelse teknik som utförs före skanning. Studier som införlivar SRμCT-metoder i sina experiment nämner kortfattat deras provtagningsprotokoll, men författarna ger föga eller ingen detalj om den särskilda metod som används för att samla in deras exemplar. Många sådana studier nämner skärning av rätlinlinja benblock av godtyckliga dimensioner, men ger i allmänhet ingen ytterligare information om verktygen eller inbäddningsmaterial somanvänds 3,4,10,11,12,13,14. Vissa forskare använder ofta handhållna roterande verktyg (t.ex. Dremel) för att ta bort rätlinjiga benblock från en region av intresse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Den här metoden resulterar i exempel av icke-uniformt storlek som kan vara större än FOV, vilket ökar sannolikheten för skanningsartefakter och bild trunkering. Sådana exemplar kräver ofta ytterligare raffinering med hjälp av en precisionsdiamantskiva (t.ex. Buehler Isomet). Att anskaffa prover med konsekventa dimensioner (till två hundradelar/mm) är avgörande för att säkerställa att de förvärvade datamängderna är av högsta kvalitet och att de efterföljande resultaten kan replikeras.
Den begränsade rapporteringen av urvalsanskaffningsmetoder lägger till ett extra skikt av svårigheter när man försöker använda och/eller validera metoder som utförts i en tidigare studie. För närvarande måste forskare kontakta författare direkt för mer information om sina provtagningsförfaranden. Protokollet som beskrivs här ger biomedicinska forskare en grundligt dokumenterad, reproducerbar och kostnadseffektiv provtagningsteknik. Det primära syftet med denna artikel är att tillhandahålla en omfattande handledning om hur man införskaffar konsekvent storlek när benkärnprover med hjälp av en kvarnborrpress och diamantkoring bit för korrekt visualisering och extraktion av mikroarchitectural data. Denna metod modifieras från procedurer som används för att rutinmässigt samla enhetliga cylindrar med liten diameter (1-5 mm) från block av hårda material i högtrycksstenmekanik15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har inte funnits något omfattande, standardiserat protokoll för införskaffande av enhetliga och cylindriska kortikala benkärnprover för högupplöst SRμCT-avbildning med begränsade FOV-inställningar. Protokollet som beskrivs här fyller det tomrummet genom att tillhandahålla en omfattande handledning om hur man införskaffar konsekvent stora kortikala benkärnprover för SRμCT-avbildning och efterföljande korrekt visualisering och extraktion av mikroarkitektiva data. Vi har visat att vårt protokoll ger en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som beskrivs i detta dokument utfördes vid BMIT-anläggningen vid Canadian Light Source, som stöds av Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, Saskatchewans regering, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada och Canadian Institutes of Health Research. Författarna vill tacka beamline-forskarna vid Canadian Light Source, särskilt Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov och Ning Zu för hjälpen med att inrätta och felsöka SkyScan SRμCT och white beam mikroskopsystem. Vi vill också tacka Beth Dalzell från University of Toledo College of Medicine and Life Sciences och Dr. Jeffrey Wenstrup vid Northeast Ohio Medical University för tillgång till cadaveric prover för denna studie. JM Andronowski stöds genom start-up forskningsfonder från University of Akron och ett Nationellt institut för rättsforskning och utveckling inom rättsvetenskap för straffrättsliga ändamål (2018-DU-BX-0188). RA Davis stöds av en forskarassistent som tillhandahålls av University of Akron. Utrustning och förnödenheter som används för coring och sågning köptes av startfonder från University of Akron och NSF beviljar EAR-1624242 till CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
