Synchrotron Micro-CT için Yüksek Verimli Kortikal Kemik Örneği Alımı ve Analizi için Kesitleme, Coring ve Görüntü İşleme Kılavuzu
Summary
İnsan femorasının ön yönünden SRμCT deneyleri için tek tip boyutta kortikal kemik örnekleri temin etmek için jeolojik (koring) örnekleme protokolü yaptık. Bu yöntem minimal yıkıcı, verimlidir, düzensiz örnek şekillerinden görüntüleme yapıtlarını en aza indiren ve mikroarşitektif görselleştirme ve analizi geliştiren silindirik örneklerle sonuçlanır.
Abstract
Kemik, insan ömrü boyunca yapısı değişen dinamik ve mekanik olarak aktif bir dokudur. Kemik remodeling işleminin ürünleri geleneksel iki boyutlu teknikler kullanılarak önemli ölçüde incelenmiştir. Masaüstü mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) ve senkrotron radyasyon mikro bilgisayarlı tomografi (SRμCT) aracılığıyla X-ışını görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, insan kortikal kemiği içindeki mikroskobik yapıların daha eksiksiz bir resmini sağlayan diğer 3D görüntüleme tekniklerine (örneğin, SEM) göre daha geniş bir görüş alanının (FOV) yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) taramalarının elde edilmesine izin verdi. Bununla birlikte, örnek, veri analizini etkilediği bilinen çizgi yapıtlarının görünümünü sınırlamak için FOV içinde doğru bir şekilde ortalanmalıdır. Önceki çalışmalar, düzensiz şekilli rektilineer kemik bloklarının tedarikinin, düzensiz kenarlar veya görüntü kesilmesi nedeniyle görüntüleme yapıtlarıyla sonuç olduğunu bildirmiştir. SRμCT deneyleri için insan femorasının ön yönünden sürekli boyutlu kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için jeolojik örnekleme protokolü (koring) uyguladık. Bu koring yöntemi verimli ve doku için minimal yıkıcıdır. Dönme sırasında izometrik olması ve tarama boyunca X-ışını ışınları için düzgün bir yol uzunluğu sağlaması nedeniyle görüntüleme yapıtlarını azaltan tekdüze silindirik örnekler oluşturur. Özlü ve düzensiz şekilli örneklerin X-ışını tomografik verilerinin görüntü işlemesi, kortikal kemik mikro mimarisinin görselleştirilmesini ve analizini iyileştirme tekniğinin potansiyelini doğrulamamaktadır. Bu protokolün bir amacı, çeşitli yüksek çözünürlüklü kemik görüntüleme deneyleri için uyarlanabilen kortikal kemik çekirdeklerinin çıkarılması için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktır. Çalışmanın kapsamlı bir amacı, SRμCT için uygun fiyatlı, tutarlı ve basit standartlaştırılmış bir kortikal kemik tedariki oluşturmaktır. Bu prosedür, biyolojik antropoloji, yerbilimleri veya malzeme bilimleri gibi sert kompozit malzemeleri yaygın olarak değerlendiren ilgili alanlardaki araştırmacılar tarafından daha da uyarlanabilir.
Introduction
Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte, X-ışını görüntüleme verilerini çok yüksek çözünürlükte elde etmek artık mümkün. Masaüstü mikro-CT (μCT) sistemleri, tahribatsız doğası nedeniyle iptal edilen kemiği görüntüleme için geçerli standarttır1. Bununla birlikte, kortikal kemiğin mikroyapısal özelliklerinin görüntülenmesi sırasında, μCT kullanımı daha sınırlı olmuştur. Çözünürlük kısıtlamaları nedeniyle, masaüstü sistemleri osteosit lacunae gibi kortikal gözeneklerden daha küçük mikroyapısal özellikleri görüntülemek için gereken çözünürlüğe sahip olamaz. Bu uygulama için, SRμCT bu sistemlerin daha fazla çözünürlüğü nedeniyle idealdir1. Örneğin, Kanada Işık Kaynağı’nda (CLS) BiyoMedikal Görüntüleme ve Terapi (BMIT) kiriş hatları2 üzerinde yapılan deneyler, 0,9 μm kadar küçük voksellerle görüntüler üretilmiştir. Önceki çalışmalar1,3,4,5 bu çözünürlüğü, insan uzun kemiklerinden kortikal kemik örneklerinden projeksiyonlar ve sonraki üç boyutlu (3D) renderlar elde etmek için kullanmıştır ( Şekil1) osteosit lacunar yoğunluğunu ölçmek için 4,6,7,8,9 ve lacunar şekli ve boyutundaki varyasyon3 insan ömrü boyunca ve cinsiyetler arasında. Daha fazla çalışma insanlarda osteon bantlama varlığını göstermiştir10Daha önce adli antropolojik literatürde sadece insan olmayan memeliler ile ilişkili olduğu bilinen bir fenomen.
Olağanüstü çözünürlüğe ulaşmak için, X-ışını ışını, genellikle maksimum numune boyutunu birkaç milimetre çapında sınırlayan görüş alanına (FOV) ince bir şekilde odaklanmalıdır. Şu anda, literatürde bu kısıtlamaları karşılayan kemik numunesi alımını özetleyen kapsamlı, standartlaştırılmış prosedürler açıklanmamıştır. FOV içindeki örneklerin ortalanması, 1) numunenin görüntüleme sırasında 180° dönerken ortalanmış kalmasını ve 2) görüntü kesilmesi olmadığından tarama yapıtlarının sınırlı olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Başka bir deyişle, numunenin FOV dışındaki hiçbir kısmı, FOV içindeki odak noktasına giren kirişe müdahale etmemektedir. Bu durumda, yeniden yapılandırma algoritması tam olarak doğru bir yeniden yapılandırma için gereken bazı zayıflama verilerinden mahrumdur. Ayrıca, 360 ° (tam dönüş) taramalarının ışın sertleştirme etkilerini en aza indirdiğini, ancak görüntüleme sırasında yanlış hizalama ve örnek hareketin neden olduğu eserleri artırdığını belirtmek gerekir. Bu nedenle, 360° tarama genellikle daha temiz veriler üretecek olsa da, görüntüleme süresi iki katına çıkarılır ve bu nedenle deneysel maliyet ile veri kalitesi arasındaki bir uzlaşma ele alınmalıdır.
Kemik görüntüleme deneylerinin önemli ve sıklıkla göz ardı edilen bir yönü, taramadan önce gerçekleştirilen doğru ve tekrarlanabilir numune hazırlama tekniğidir. SRμCT yöntemlerini deneylerine dahil eden çalışmalar, örnekleme protokollerinden kısaca bahseder, ancak yazarlar örneklerini toplamak için kullanılan belirli metodoloji hakkında çok az ayrıntı sağlarlar. Bu tür çalışmaların çoğu, rastgele boyutlardaki rektilinear kemik bloklarının kesilmesinden bahseder, ancak genellikle 3 , 4 , 10 , 11,12,13,14kullanılan aletler veya gömme malzemeleri hakkında daha fazla bilgi sağlamaz. Bazı araştırmacılar genellikle ilgi çekici bir bölgeden (ROI) rektilinear kemik bloklarını çıkarmak için el tipi döner aletler kullanırlar (örneğin, Dremel) 3,4,10,11,12,13,14. Bu yöntem, FOV’dan daha büyük olabilecek, tarama yapıtlarının ve görüntü kesilme olasılığını artıran, biçimsiz boyutlandırılmış örneklerle sonuçlanır. Bu tür numuneler genellikle hassas bir elmas gofret testeresi (örneğin, Buehler Isomet) kullanılarak daha fazla rafine etmeyi gerektirir. Elde edilen veri kümelerinin en yüksek kalitede olduğundan ve sonraki sonuçların yinelenebilir olduğundan emin olmak için tutarlı boyutlara sahip örneklerin (yüzde ikiye/mm’ ye) tedariki önemlidir.
Numune tedarik metodolojisinin sınırlı raporlaması, önceki bir çalışmada gerçekleştirilen yöntemlerin kullanımına ve/veya doğrulandırılmaya çalışıldığında ekstra bir zorluk katmanı ekler. Şu anda, araştırmacılar örnekleme prosedürleri hakkında daha fazla bilgi için doğrudan yazarlarla iletişime geçmelidir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, biyomedikal araştırmacılara iyice belgelenmiş, çoğaltılabilir ve uygun maliyetli bir örnekleme tekniği sağlar. Bu makalenin birincil amacı, mikroaritektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması için bir freze matkap presi ve elmas coring biti kullanarak sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi konusunda kapsamlı bir öğretici sağlamaktır. Bu yöntem, yüksek basınçlı kaya mekaniğindeki sert malzeme bloklarından tek tip, küçük çaplı (1-5 mm) silindirleri rutin olarak toplamak için kullanılan prosedürlerden15 , 16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sınırlı FOV kurulumları ile yüksek çözünürlüklü SRμCT görüntüleme için tek tip ve silindirik kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için kapsamlı, standartlaştırılmış bir protokol olmamıştır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, SRμCT görüntüleme için sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi ve daha sonra mikroarctektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması hakkında kapsamlı bir öğretici…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makalede açıklanan araştırma, Kanada Yenilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Saskatchewan Üniversitesi, Saskatchewan Hükümeti, Batı Ekonomik Çeşitlendirme Kanada, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri tarafından desteklenen Kanada Işık Kaynağı’ndaki BMIT tesisinde gerçekleştirildi. Yazarlar, Kanada Işık Kaynağı’ndaki beamline bilim adamlarına, özellikle Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov ve Ning Zu’ya SkyScan SRμCT ve beyaz ışın mikroskop sistemlerinin kurulumu ve sorunlarının giderilmesindeki yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Toledo Üniversitesi Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji’nden Beth Dalzell’e ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi’nden Dr. Jeffrey Wenstrup’a bu çalışma için kadavra örneklerine erişim için teşekkür ederiz. JM Andronowski, Akron Üniversitesi ve Adli Bilimler Adli Bilimler Ulusal Adalet Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanan başlangıç araştırma fonları (2018-DU-BX-0188) ile desteklenmektedir. RA Davis, Akron Üniversitesi tarafından sağlanan bir lisansüstü asistanlık tarafından desteklenmektedir. Koring ve testereleme için kullanılan ekipman ve malzemeler, Akron Üniversitesi ve NSF tarafından CW Holyoke’ye EAR-1624242 hibesi tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından satın alındı.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
