Det presenterade protokollet beskriver transport och beredning av resected mänskliga hippocampus vävnad med det slutliga målet att använda vitala hjärnan skivor som en preklinisk utvärdering verktyg för potentiella antiepileptiska ämnen.
Epilepsi drabbar ca 1% av världens befolkning och leder till en allvarlig minskning av livskvaliteten på grund av pågående anfall samt hög risk för plötslig död. Trots ett överflöd av tillgängliga behandlingsalternativ är cirka 30% av patienterna läkemedelsresistenta. Flera nya terapier har utvecklats med hjälp av djurmodeller, även om andelen läkemedelsresistenta patienter fortfarande är oföränderlig. En av troliga orsaker är bristen på översättning mellan gnagare modeller och människor, såsom en svag representation av mänskliga pharmacoresistance i djurmodeller. Resected mänskliga hjärnvävnaden som en preklinisk utvärdering verktyg har fördelen att överbrygga denna translationella gap. Beskrivs här är en metod för hög kvalitet beredning av mänskliga hippocampus hjärnan skivor och efterföljande stabil induktion av epileptiform aktivitet. Protokollet beskriver induktion av burst aktivitet under tillämpning av 8 mM KCl och 4-aminopyridin. Denna verksamhet är känslig för etablerade AED-lacosamid eller nya antiepileptiska kandidater, såsom dimetyletanolamin (DMEA). Dessutom beskriver metoden induktion av beslag-liknande händelser i CA1 av mänskliga hippocampus hjärnan skivor genom minskning av extracellulära Mg2 + och tillämpning av bicuculline, en GABAA receptor blockerare. Den experimentella set-up kan användas för att skärmen potentiella antiepileptiska ämnen för deras effekter på epileptiform aktivitet. Vidare kan verkningsmekanismer som postuleras för specifika föreningar valideras med hjälp av detta tillvägagångssätt i mänsklig vävnad (t.ex. med hjälp av patch-clamp-inspelningar). Som avslutning kommer undersökningen av vitala mänskliga hjärnvävnad ex vivo (här, resected hippocampus från patienter som lider av temporala lob epilepsi) förbättra den nuvarande kunskapen om fysiologiska och patologiska mekanismer i den mänskliga hjärnan.
Epilepsi är en av de vanligaste neurologiska sjukdomar, som påverkar 1% av världens befolkning, och är associerad med ökad sjuklighet ochdödlighet 1,2. Tyvärr är en tredjedel av patienterna som lider av epilepsi läkemedelsresistenta, trots ett överflöd av tillgängliga behandlingsalternativ inklusive mer än 20 godkända antiepileptiska läkemedel (AED)3. Underlåtenhet att översätta resultat från preklinisk djurforskning till kliniska prövningar är en anledning till att lovande behandlingsstrategier inte är effektiva hos många patienter4. Nyligen, neuropeptid Y (NPY) och galanin har visat sig ha antiepileptiska effekter i djurmodeller; dock, när de testas i resected mänskliga hjärnvävnaden, endast NPY var effektiv5.
De flesta av de befintliga kunskaper som rör grundläggande neurologiska mekanismer och metoder sjukdom terapi härrör från djurmodeller och cellodling experiment. Även om informativa, dessa modeller endast representerar enstaka aspekter av komplexa mänskliga sjukdomar och den vuxna mänskliga hjärnan nätverk. Alternativt har mänsklig hjärnvävnad potential att överbrygga den translationella klyftan men är sällan tillgänglig för funktionella studier. Till exempel, post mortem hjärnvävnad har varit ett värdefullt verktyg för att undersöka proteinuttryck, hjärnans morfologi, eller anatomiska anslutningar, även om neuronal aktivitet ofta äventyras är denna vävnad6,7,8,9,10,11.
Däremot har levande resected mänskliga hjärnvävnaden undersökts om preklinisk läkemedelsutvärdering, grundläggande neuronala funktioner och genuttryck mönster12,13,14,15,16,17. En stor fördel med mänskliga hjärnan skivor jämfört med gnagare skivor är den långa livskraften hos neuronal vävnad efter samband och beredning. Jämfört med gnagare hjärnan skivor, som vanligtvis kan registreras i upp till 8 h efter beredning, mänskliga hjärnan skivor visar stabil neuronal aktivitet i upp till 72 h, möjliggör grundlig undersökning av dessa sällsynta och värdefulla prover12,18.
Flera studier har undersökt egenskaper av epileptiform aktivitet i olika områden av resected när och hippocampus mänsklig vävnad och använt olika metoder för induktion av epileptiform aktivitet. I gnagare skivor, epileptiform aktivitet kan induceras genom flera metoder: elektrisk stimulering av GD hilar celler, ökning av extracellulära K+ (8–12 mM KCl), blockering av GABA A-receptorer genom bicuculline (BIC), blockering av kaliumkanaler med 4-aminopyridine (4-AP), och ta bort eller minska Mg2 + i extracellulär lösning19.A Induktion av epileptiform aktivitet i mänsklig vävnad kräver dock kombinationen av minst två av de ovan nämnda metoderna20,21,22.
Presenteras här är en metod för beredning av mänskliga hippocampus hjärnan skivor, som är livskraftiga för upp till 20 h och visa induktion av epileptiform aktivitet vid tillämpning av hög K+ (8 mM) och 4-AP eller låg Mg2 + och BIC.
Living resected mänskliga hjärnvävnaden är ett mycket värdefullt verktyg i preklinisk utvärdering av AED, eftersom det korrekt representerar en intakt mänskliga hjärnan mikro-nätverk. Det presenterade protokollet beskriver en metod för vävnad transport och beredning, som säkerställer hög kvalitet hippocampus skivor samt en stabil induktionsmetod för epileptiform verksamhet kritisk för AED utvärdering.
Utredning av epileptiform aktivitet samt metoder för kemisk eller elektrisk induktion i mänskliga hjärnskivor har tidigare visats av andra grupper17,20,21,22. Detta protokoll beskriver induktion av stabil burst aktivitet i skivor från olika patienter via tillämpning av hög K++4-AP samt induktion av SLEs i CA1 område via tillämpning av låga Mg2 +BIC. Det konstaterades att induktion av burst aktivitet är mer konsekvent (80% av testade skivor i 15 patienter) än induktion av SES (50% av testade skivor i en patient). Hittills har dock induktion av SES endast testats hos en patient. Trots detta rekommenderas induktion av slEs av låga Mg2++BIC, eftersom slEs ännu inte har kunnat induceras med hjälp av hög K++4-AP.
Flera studier har infört metoder för transport och beredning av mänskliga hjärnvävnad och ofta belysa tre faktorer som är avgörande för neuronal överlevnad: transport tid, används transportlösningar, och lagra villkor.
För optimal skiva livskraft, vissa grupper tyder på att transporten av resected hjärnvävnad vara så kort som möjligt. Driftrum och laboratorier ligger dock sällan i närheten, vilket innebär att segmentkvaliteten kan äventyras på grund av långa transporter. Vissa grupper har övervunnit detta hinder genom att tillämpa konstant O2 på lösningen under transport12. Vi har transporterat hjärnvävnad för kort (max = 15 min) och långa (upp till 1 h) tidsperioder utan konstant ytterligare O2 försörjning under transport, liknande andra grupper18,25. I dessa fall observerades inte skillnader i vävnadskvalitet under epileptiform-inspelningar. I kommunikation med andra grupper på vårt institut, skiva kvalitet inte förändras för patch-clamp experiment heller. Däremot beror varians i vävnadskvalitet möjligen från skador under operationer, långvarig resektion och skivningsprocedur.
Angående transport- och skärlösning utelämnar alla publicerade metoder NaCl från lösningar för att minska cellsvullnad på grund av osmotisk tryck, liknande standardproceduren för gnagare patch-clamp experiment. Emellertid, flera substitut har införts hittills (dvs., sackaros baserade aCSF13,22, NMDG-baserade aCSF12,26, och kolin-baserade aCSF27). Ting och kollegor introducerade NMDG-baserade aCSF för skiva beredning i 201426 och senare lagt till ett återhämtningsprotokoll, som långsamt återinför NaCl tillskivorna 28. Men som beskrivs av Ting et al., nervceller av hjärnvävnad som utarbetats i NMDG-baserade aCSF visa högre membran motstånd, vilket påverkar hela-cellen tätning under patch-clamp experiment26. Därför har vi övergått från NMDG-baserade aCSF till användning av kolin-baserade aCSF20, som ger hög kvalitet skivor för både fält potential och patch-clamp inspelningar.
När det gäller lagring av skivor är det allmänt accepterat att gränssnittsförhållanden ger optimal syresättning kritisk för lång skiva överlevnad18. Andra grupper visar dock skiva överlevnad för upp till 72 h under nedsänkta förhållanden12. I motsats till tidigare hypotes, mänskliga hjärnan skivor verkar vara mer resistenta mot låg syresättning eller oxidativ stress jämfört med gnagare skivor. I första hand har gränssnittskammare tidigare använts för lagring av mänskliga hippocampusskivor, men under vattenvillkor rekommenderas för underhåll av mänskliga hjärnskivor i patch-clamp-experiment.
Som diskuteras av andra grupper, ett ytterligare kritiskt steg för lång skiva överlevnad (gränssnitt för <48 h18, nedsänkt för <72 h12) är förebyggande av bakteriell kontaminering. Gnagare hjärnskivor används vanligtvis i elektrofysiologiska inspelningar i upp till 8 h, och bakteriell kontaminering anses inte påverka segmentens livskraft under denna period. Stort antal skivor som utarbetats från en resektion och den ovanliga tillgången på mänsklig hjärnvävnad belyser behovet av att förlänga livskraften hos mänskliga hjärnskivor. Denna metod beskriver framgångsrikt beredningen av levande mänskliga hippocampus hjärnan skivor, som lätt kan anpassas till sterila förhållanden. Men för inspelningarna som utförs här, skiva överlevnad sträcker 20 h var inte en prioritet.
Registrering i gränssnittskammare har också visat sig vara väsentlig för induktion av epileptiform aktivitet såsom sles22. Nedsänkta förhållanden, på grund av låg syresättning, används sällan för registrering av SLEs; dock, de är nödvändiga för optisk hög upplösning som behövs för patch-clamp experiment. Användningen av en optimerad nedsänkt typ inspelning kammare möjliggör inspelning av epileptiform aktivitet (extracellulärt fält eller enda neuron) i mänskliga hjärnan skivor, på grund av hög syresättning och snabb läkemedelsapplikation29. Här beskrivs metoder och resultat för fältpotentialinspelningar, men det bör betonas att patch-clamp-inspelningar framgångsrikt har utförts i mus- och människohjärnskivor med hjälp av denna modifierade inspelningskammare (data som inte visas).
Resected mänskliga hjärnvävnaden har ett högre translationellt värde jämfört med gnagare modeller. Det representerar en vuxen, sjuka neuronal nätverk som inte kan reproduceras av iPSCs. Men som i alla in vitro-system, mänskliga hjärnan skivor representerar inte en intakt mänsklig hjärna. Dessutom kan de registrerade neuronala nätverken av resected hjärnvävnad genomgå betydande molekylära och funktionella förändringar på grund av skador under drift eller beredning. Skivningsprocedurer har visat sig påverka GABAerga funktion och kan påverka induktionen av epileptiform aktivitet30. Dessa begränsningar bör övervägas samtidigt som man formulerar en hypotes. Vid testning av potentiella antiepileptiska läkemedel bör användningen av olika hjärnområden övervägas, eftersom läkemedelsmålen kanske inte uttrycks i alla mänskliga hjärnregioner eller alla patienter. I synnerhet visar hippocampi av TLE patienter ofta tecken på hippocampus skleros åtföljs av allvarliga neuronala cellförlust. Det rekommenderas att få patientinformation om patologiska förändringar och sjukdomshistoria, såsom potentiella eldfasta mot mediciner, och överväga detta under data tolkning.
Sammanfattningsvis beskriver denna metod framgångsrikt utarbetandet av levande mänskliga hippocampus hjärnan skivor och induktionstekniker för inspelning av två olika typer av epileptiform aktivitet. Eftersom tillgången på levande mänsklig hjärnvävnad är sällsynt, bör optimerade transport- och inspelningsförhållanden användas för att säkerställa maximal utmatning från experiment med hjälp av mänskliga hjärnskivor. det föreslås att resected mänskliga hjärnvävnaden kan användas som en preklinisk validering verktyg utöver gnagare modeller och cellodling experiment.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) för utmärkt tekniskt bistånd. P.F. finansierades av den tyska forskningsstiftelsen (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) enligt Tysklands excellence strategy-EXC-2049-390688087. Detta arbete har fått stöd av QUEST Center for Transforming Biomedical Research vid Institutet för hälsa i Berlin.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |