Den presenterte protokollen beskriver transport og fremstilling av resected human hippocampal vev med det endelige målet å bruke vitale hjerneskiver som et preklinisk evalueringsverktøy for potensielle antiepileptiske stoffer.
Epilepsi påvirker ca 1% av verdens befolkning og fører til en alvorlig reduksjon i livskvaliteten på grunn av pågående anfall samt høy risiko for plutselig død. Til tross for en overflod av tilgjengelige behandlingstilbud, er ca 30% av pasientene resistente. Flere nye terapeutiske midler er utviklet ved hjelp av dyremodeller, selv om frekvensen av legemiddelresistente pasienter forblir uendret. En av sannsynlige årsaker er mangelen på oversettelse mellom gnagermodeller og mennesker, for eksempel en svak representasjon av menneskelig farmakolysistance i dyremodeller. Resected menneskelig hjernevev som et preklinisk evalueringsverktøy har fordelen av å bygge bro over dette translasjonelle gapet. Beskrevet her er en metode for høy kvalitet forberedelse av menneskelige hippocampal hjerneskiver og påfølgende stabil induksjon av epileptiform aktivitet. Protokollen beskriver induksjon av burst aktivitet under påføring av 8 mM KCl og 4-aminopyridin. Denne aktiviteten er følsom for etablerte AED lacosamide eller nye antiepileptiske kandidater, som dimetyletanolamin (DMEA). I tillegg beskriver metoden induksjon av anfallslignende hendelser i CA1 av menneskelige hippocampal hjerneskiver ved reduksjon av ekstracellulær Mg2 + og anvendelse av bikuculline, en GABAA reseptorblokker. Det eksperimentelle oppsettet kan brukes til å screene potensielle antiepileptiske stoffer for deres effekter på epileptiform aktivitet. Videre kan virkningsmekanismer postulert for bestemte forbindelser valideres ved hjelp av denne tilnærmingen i menneskelig vev (f.eks. ved hjelp av patch-clamp opptak). For å konkludere, vil undersøkelse av vital humant hjernevev ex vivo (her, resected hippocampus fra pasienter som lider av temporal lobe epilepsi) forbedre dagens kunnskap om fysiologiske og patologiske mekanismer i den menneskelige hjernen.
Epilepsi er en av de vanligste nevrologiske lidelsene, som påvirker 1% av verdens befolkning, og er forbundet med økt sykelighet ogdødelighet 1,2. Dessverre er en tredjedel av pasientene som lider av epilepsi resistente, til tross for en overflod av tilgjengelige behandlingstilbud, inkludert mer enn 20 godkjente antiepileptiske legemidler (AEDer)3. Unnlatelse av å oversette resultater fra preklinisk dyreforskning til kliniske studier er en grunn til at lovende behandlingsstrategier ikke er effektive hos mange pasienter4. Nylig har nevropeptid Y (NPY) og galanin vist seg å ha antiepileptiske effekter i dyremodeller; skjønt, når testet i resected menneskelig hjernevev, bare NPY vareffektive 5.
Mesteparten av den eksisterende kunnskapen om grunnleggende nevrologiske mekanismer og sykdomsterapi tilnærminger stammer fra dyremodeller og cellekultureksperimenter. Selv om de er informative, representerer disse modellene bare enkeltaspekter ved komplekse menneskelige sykdommer og det voksne menneskelige hjernenettverket. Alternativt har menneskelig hjernevev potensial til å bygge bro over det translasjonelle gapet, men er sjelden tilgjengelig for funksjonelle studier. For eksempel har post mortem hjernevev vært et verdifullt verktøy for å undersøke proteinuttrykk, hjernemorfologi eller anatomiske forbindelser, selv om nevronal aktivitet ofte er kompromittert er dettevevet 6,7,8,9,10,11.
I motsetning har levende resected menneskelig hjernevev blitt undersøkt om preklinisk narkotikaevaluering, grunnleggende nevronale funksjoner og genuttrykksmønstre12,13,14,15,16,17. En stor fordel med menneskelige hjerneskiver sammenlignet med gnagerskiver er den lange levedyktigheten til nevronalt vev etter reseksjon og forberedelse. Sammenlignet med gnagerhjerneskiver, som vanligvis kan registreres i opptil 8 timer etter forberedelse, viser menneskelige hjerneskiver stabil nevronal aktivitet i opptil 72 timer, noe som muliggjør grundig undersøkelse av disse sjeldne og verdifulle prøvene12,18.
Flere studier har undersøkt egenskapene til epileptiform aktivitet i ulike områder av resected kortikale og hippocampal menneskelig vev og brukt ulike metoder for induksjon av epileptiform aktivitet. I gnagerskiver kan epileptiformaktivitet induseres ved flere metoder: elektrisk stimulering av DG hilarceller, økning av ekstracellulære K+ (8–12 mM KCl), blokkering av GABA A-reseptorer ved bikucullin (BIC), blokkering av kaliumkanaler ved 4-aminopyridin (4-AP), og fjerning eller reduksjon av Mg2+ i ekstracellulær oppløsningA 19. Induksjon av epileptiform aktivitet i humant vev krever imidlertid kombinasjonen av minst to av de ovennevnte metodene20,,21,,22.
Presentert her er en metode for fremstilling av menneskelige hippocampal hjerneskiver, som er levedyktige i opptil 20 timer og viser induksjon av epileptiform aktivitet ved påføring av høy K+ (8 mM) og 4-AP eller lav Mg2 + og BIC.
Levende resected menneskelig hjernevev er et svært verdifullt verktøy i preklinisk evaluering av AEDer, som det riktig representerer en intakt menneskelig hjerne mikro-nettverk. Den presenterte protokollen beskriver en metode for vevstransport og forberedelse, som sikrer hippocampalskiver av høy kvalitet, samt en stabil induksjonsmetode for epileptiformaktivitet som er kritisk for AED-evaluering.
Undersøkelse av epileptiform aktivitet samt metoder for kjemisk eller elektrisk induksjon i menneskelige hjerneskiver har tidligere blitt vist av andregrupper 17,20,21,22. Denne protokollen beskriver induksjon av stabil burst aktivitet i skiver fra forskjellige pasienter via anvendelse av høy K++4-AP samt induksjon av SLEs i CA1-området via anvendelse av lav Mg2 ++BIC. Det ble funnet at induksjonen av burst aktivitet er mer konsekvent (80% av testede skiver hos 15 pasienter) enn induksjon av SSE (50% av testede skiver i en pasient). Men så langt har induksjonen av SN-er bare blitt testet hos én pasient. Likevel anbefales induksjon av SLE ved lav Mg2++BIC, da SN-er ennå ikke har vært i stand til å bli indusert ved hjelp av høy K++4-AP.
Flere studier har innført metoder for transport og fremstilling av menneskelig hjernevev og fremhever ofte tre faktorer som er kritiske for nevronal overlevelse: transporttid, brukte transportløsninger og lagringsforhold.
For optimal skive levedyktighet, noen grupper foreslår at transport av resected hjernevev være så kort som mulig. Operasjonsrom og laboratorier er imidlertid sjelden i nærheten, noe som betyr at skivekvaliteten kan bli kompromittert på grunn av lang transport. Noen grupper har overvunnet denne hindringen ved å bruke konstant O2 til løsningen under transport12. Vi har transportert hjernevev for kort (maks = 15 min) og lange (opptil 1 time) perioder uten konstant ekstra O2 forsyning under transport, lik andre grupper18,,25. I disse tilfellene ble forskjeller i vevskvalitet ikke observert under epileptiformopptak. I kommunikasjon med andre grupper ved vårt institutt, skiver kvalitet ikke endres for patch-klemme eksperimenter, heller. I motsetning, varians i vevkvalitet muligens stammer fra skade under operasjoner, langvarig reseksjon, og kutting prosedyre.
Når det gjelder transport- og skjæreløsning, utelater alle publiserte metoder NaCl fra løsninger for å redusere cellehevelse på grunn av osmotisk trykk, som ligner på standardprosedyren for gnagerpatch-klemmeeksperimenter. Imidlertid har flere substitunter blitt introdusert så langt (det vil vil vil at sukrose basert aCSF13,22, NMDG-baserte aCSF12,26og kolinbasert aCSF27). Ting og kolleger introduserte NMDG-baserte aCSF for skiveforberedelse i 201426 og senere lagt til en gjenopprettingsprotokoll, som sakte gjeninnfører NaCl til skiver28. Men, som beskrevet av Ting et al., nevroner av hjernevev tilberedt i NMDG-baserte aCSF viser høyere membran motstand, og dermed påvirker hele cellen segl under patch-klemme eksperimenter26. Derfor har vi gått fra NMDG-basert aCSF til bruk av kolinbasert aCSF20, som gir høy kvalitet skiver for både feltpotensial og patch-clamp opptak.
Når det gjelder lagring av skiver, er det allment akseptert at grensesnittforhold gir optimal oksygenering kritisk for lang skive overlevelse18. Andre grupper viser imidlertid skiveoverlevelse i opptil 72 timer under under nedsenkede forhold12. I motsetning til tidligere hypotese synes menneskelige hjerneskiver å være mer motstandsdyktige mot lav oksygenering eller oksidativt stress sammenlignet med gnagerskiver. Primært har grensesnittkamre tidligere blitt brukt til lagring av menneskelige hippocampalskiver, selv om nedsenkede forhold anbefales for vedlikehold av menneskelige hjerneskiver i patch-clamp eksperimenter.
Som det diskuteres av andre grupper, er et ekstra kritisk skritt for lang skiveoverlevelse (grensesnitt for <48 t18, nedsenket for <72 h12) forebygging av bakteriell forurensning. Gnagerhjerneskiver brukes vanligvis i elektrofysiologiske opptak i opptil 8 timer, og bakteriell forurensning anses ikke å påvirke skive levedyktighet i denne perioden. Høyt antall skiver tilberedt fra en reseksjon og den uvanlige tilgjengeligheten av menneskelig hjernevev understreker behovet for å forlenge levedyktigheten til menneskelige hjerneskiver. Denne metoden beskriver vellykket utarbeidelsen av levende menneskelige hippocampal hjerneskiver, som lett kan tilpasses sterile forhold. Men for opptakene som ble utført her, var skiveoverlevelse som strekker seg 20 timer ikke en prioritet.
Opptak i grensesnittkamre har også vist seg å være avgjørende for induksjon av epileptiform aktivitet som SlEs22. Nedsenkede forhold, på grunn av lav oksygenering, brukes sjelden til registrering av E-slEs; skjønt, de er nødvendige for optisk høy oppløsning som trengs for patch-klemme eksperimenter. Bruken av et optimalisert nedsenket type opptakskammer muliggjør registrering av epileptiform aktivitet (ekstracellulær felt eller enkelt neuron) i menneskelige hjerneskiver, på grunn av høy oksygenering og rask legemiddelapplikasjon29. Her er metoder og resultater for feltpotensiale opptak beskrevet, men det bør understrekes at patch-clamp-opptak har blitt utført i mus og menneskelige hjerneskiver ved hjelp av dette modifiserte opptakskammeret (data som ikke vises).
Resected menneskelig hjernevev har en høyere translasjonell verdi sammenlignet med gnagermodeller. Det representerer et voksent, sykt nevronalt nettverk som ikke kan reproduseres av iPSCer. Men som i alle in vitro-system representerer menneskelige hjerneskiver ikke en intakt menneskelig hjerne. I tillegg kan de registrerte nevronale nettverkene av resected hjernevev gjennomgå betydelige molekylære og funksjonelle endringer på grunn av skade under drift eller forberedelse. Kuttingsprosedyrer har vist seg å påvirke GABAergic-funksjonen og kan påvirke induksjon av epileptiformaktivitet30. Disse begrensningene bør vurderes mens du formulerer en hypotese. Ved testing av potensielle antiepileptiske legemidler bør bruk av ulike hjerneområder vurderes, da legemiddelmål kanskje ikke uttrykkes i alle menneskelige hjerneregioner eller alle pasienter. Spesielt viser hippocampi av TLE-pasienter ofte tegn på hippocampal sklerose ledsaget av alvorlig nevronalt celletap. Det anbefales å innhente pasientinformasjon om patologiske endringer og sykdomshistorie, for eksempel potensiell ildfast mot medisiner, og vurdere dette under datatolkning.
Til slutt beskriver denne metoden vellykket utarbeidelsen av levende menneskelige hippocampal hjerneskiver og induksjonsteknikker for å registrere to forskjellige typer epileptiformaktivitet. Siden tilgjengeligheten av levende menneskelig hjernevev er sjelden, bør optimaliserte transport- og opptaksforhold brukes til å sikre maksimal utgang fra eksperimenter ved hjelp av menneskelige hjerneskiver. Det foreslås at resected menneskelig hjernevev kan brukes som et preklinisk valideringsverktøy i tillegg til gnagermodeller og cellekultureksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) for utmerket teknisk assistanse. P.F. ble finansiert av German Research Foundation (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) under Tysklands Excellence Strategy-EXC-2049-390688087. Dette arbeidet har blitt støttet av QUEST Center for Transforming Biomedical Research ved Berlin Institute of Health.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |