Præsenteret her er en protokol for primær human blod monocyt isolation samt deres differentiering i makrofager og dendritiske celler og samling med epitelceller i en multicellulær menneskelige lunge model. Biologiske reaktioner af cocultures bestående af immunceller differentieret fra enten frisk isolerede eller optøede monocytter, ved udsættelse for proinflammatoriske stimuli, sammenlignes.
En human alveolær celle coculture model er beskrevet her for simulering af alveolær epitelvæv barriere bestående af alveolær epitel type II celler og to typer af immunceller (dvs. humant monocyt-afledte makrofager [MDMs] og dendritiske celler [MDDCs]). Der findes en protokol til samling af den flercellede model. Alveolær epitelceller (A549 celle linje) dyrkes og differentieres under neddykkede forhold på gennemtrængelige skær i to-kammer brønde, derefter kombineret med differentierede MDMs og MDDCs. Endelig er cellerne udsat for en luft-væske interface i flere dage. Da humane primære immunceller skal isoleres fra menneskelige buffycoats, sammenlignes immunceller, der adskiller sig fra enten friske eller optøede monocytter, for at skræddersy metoden baseret på eksperimentelle behov. De tredimensionale modeller, der består af alveolær celler med enten nyisolerede eller optøede monocyt-afledte immunceller, viser en statistisk signifikant stigning i cytokin (interleukins 6 og 8) frigivelse ved eksponering for proinflammatoriske stimuli (lipopolysaccharid og tumornekrose faktor α) sammenlignet med ubehandlede celler. På den anden side er der ingen statistisk signifikant forskel mellem cytokin frigivelse observeret i cocultures. Dette viser, at den præsenterede model er lydhør over for proinflammatoriske stimuli i overværelse af MDMs og MDDCs differentieret fra friske eller optøede perifere blod monocytter (PbMs). Det er således et effektivt redskab til undersøgelser af akut biologisk reaktion på forskellige stoffer, herunder aerosoliserede lægemidler eller nanomaterialer.
In vitro lungecellekulturer tilbyder omkostningseffektive, robuste og velkontrollerede platforme til at vurdere farerne ved aerosoler1. Som en model celle system for humane alveolær pneumocytter, epitel A549 celle linje isoleret fra en pulmonal adenocarcinom bruges ofte2. Disse celler repræsenterer planocellulær type II-epitelceller fra alveolær region3 og er en meget anvendt lungecellelinje til vurdering af farer ogtoksicitet 1,4,5,6,7,8,9,10. A549-cellelinjen har relevante træk ved alveolær epiteltype II-celler, såsom tilstedeværelsen af karakteristiske lamellarstoffer, der indeholder tætpakkede fosfolipider3.
Det er blevet påvist, at når cellerne dyrkes ved en luft-væske interface (ALI), overfladeaktivt stof frigives på den apikale side af luft-eksponerede epitelceller, reducere overfladespænding11,,12,13. Denne funktion er særlig vigtig i nanomateriale luftvejsrisiko og toksicitet undersøgelser. Når inhaleret nanomaterialer / toksikanter er deponeret i alveolær regionen, de først interagerer med lunge overfladeaktive og er fordrevet ved befugtning kræfter i den vandige hypofase, hvor samspillet med lungeceller finder sted14,15. Selv om A549 celler danner et monolag (som kan overgrow i flerlags på senere tidspunktpunkter, når de dyrkes på ALI) og producere overfladeaktive, en ulempe er deres utilstrækkelige stramme samling dannelse, hvilket resulterer i lav transepithelial elektrisk modstand værdier, men stadig udgør en funktionel barriere mod intercellulære (nano)partikler omplantning16,17,18.
I lungerne er der en række immuncellepopulationer, herunder fagocytiske og professionelle antigen-præsenterende celler (dvs. makrofager og dendritiske celler), der kommunikerer direkte gennem cellecellekontakt eller intercellulær signalering for at kontrollere og vedligeholde homøostase. Makrofager og dendritiske celler er kritiske medfødte immuneffektorer og initiativtagere til det adaptive immunrespons19. Dendritiske celler, der bor i eller under epitel, kan danne fremspring på tværs af epitel til lumen for at fange antigener. Alveolær makrofager er placeret på den apikale overflade af epitel og fungere som sentinel celler, der repræsenterer den første cellulære forsvar mod fremmed materiale samt bakterielle, virale og svampeinfektioner. Deres fænotopypiske plasticitet giver mulighed for hurtigt induktion af proinflammatoriske reaktioner som reaktion på sådanne stimuli samt at flytte til udløsende anti-inflammatoriske (dvs. hæmmende) reaktioner20.
For at simulere den humane alveolær epitelvævsbarriere etablerede vi en tredobbelt cokulturmodel med A549-celler suppleret med humane blodmoncytafledte makrofager (MDMs) og dendritiske celler (MDDCs) på de apiske basale og basale sider,henholdsvis 17. Dyrkning af denne model hos ALI er tidligere blevetrapporteret 16, endda op til 72 timer efter eksponering21. Akut immunrespons på kulstofnanorør eksponeringer blev væsentligt forbedret i cellekultur udsat for ALI i forhold til neddykkede betingelser22. Coculture model, dyrket og udsat for forskellige materialer på ALI, har tidligere været brugt til at undersøge cytotoksicitet, oxidativstress og inflammatoriske reaktioner på eksponering for zinkoxid,23 grafen-relateredematerialer 24, guldpartikler25,26, kulstof nanorør21, og vulkansk aske og diesel udstødning partikler27.
Endvidere er den vigtige rolle, som makrofager og dendritiske celler spiller som immuneffektorceller i en in vitro-lungemodel, blevet bekræftet. Især blev der kun observeret en øget proinflammatorisk respons i modellen ved tilstedeværelse af immunceller sammenlignet med monokultursystemer7. Potentielle ulemper ved at anvende primære monocytafledte immunceller er den begrænsede adgang til PbM’er samt donor-til-donor-variation. Som en løsning på disse potentielle ulemper, præsenteret her er en protokol, der indfører kryopræservering af frisk isolerede PBMs28 for cellekultur model forsamling. Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere 3D human alveolær epitelvæv model samling, herunder isolering af PbMs fra menneskelige buffy frakker. Reaktionsevnen over for proinflammatoriske stimuli sammenlignes med modellen, der består af MDM’er og MDDC’er, der er differentieret fra friske PBM’er eller differentieret fra frosne/optøede PbM’er.
Arbejde med uprøvede humane blodprøver indebærer særlig pleje for at forhindre potentiel overførsel af smitsomme sygdomme, såsom HIV (human immundefekt virus), hepatitis B, og hepatitis C. Derfor er brugen af personlige beskyttelsesforanstaltninger såsom handsker, kjoler, masker og øjenbeskyttelse afgørende og skal være i overensstemmelse med principperne for god laboratoriepraksis. Disse beskyttelser reducerer risikoen for at udsætte huden eller slimhinderne for potentielt infektiøse væsker. For dem, der er involveret i håndtering af buffy coats og PbMs, vaccination mod hepatitis B-virus er obligatorisk, og blod titer niveauer af antistoffer anti-hepatitis B skal være over 100 IE / L (landespecifikke lovgivningsmæssige krav skal behandles). Desuden skal alt arbejde udføres i laboratorier på biosikkerhedsniveau 2 (landespecifikke lovkrav skal behandles). Der bør vedtages standardforanstaltninger for sundhed og sikkerhed i forbindelse med arbejde i et laboratoriemiljø og håndtering af cellekulturen for pattedyr, herunder håndtering af affald, når hele protokollen gennemføres.
Ny produktion af nye materialer, herunder kemikalier og narkotika, øger gradvist behovet for prædiktive in vitro-modeller. For at overholde de tre principper for udskiftning, reduktion og raffinering afdyreforsøg 32er in vitro-cellemodeller blevet effektive værktøjer til udskiftning og reduktion af mekanismer til belysning af mekanismerne i et lægemiddels eller materialesindsats 8,9,10,11. Præsenteret her er en detaljeret protokol for at samle den flercellede model ved hjælp af immunceller, der enten er frisk isoleret eller optøet fra tidligere frosne monocytter. Også beskrevet er dyrkning af modellen på ALI. Endelig illustrerer protokollen et eksempel på eksponering for proinflammatoriske stimuli og sammenligner reaktionen fra de to modeller, der indeholder enten friske eller frosne monocytter.
Der er udført forskellige undersøgelser for at bekræfte og begrunde merværdien af den øgede kompleksitet af de modeller , der dyrkes og eksponeres under ALI-forhold , sammenlignet med konventionel neddykketeksponering 7,22,31. Observation af den højere proinflammatoriske respons i cocultures sammenlignet med monokulturer af epitelceller bekræfter en tidligere undersøgelse. Undersøgelsen anvendte den præsenterede cokulturmodel (stimuleret med LPS) og viste en højere respons ved genekspressionsniveauerne for TNF og IL1B sammenlignet med A549 monokulturækvivalent model7. På den anden side viste begge modeller større variationer inden for målte proinflammatoriske mediator frigivelsesværdier sammenlignet med A549 monokulturer. Dette kan forklares ved brug af immunceller fra forskellige donorer (buffy coats) i biologiske gentagelser (dvs. en gentagelse, en donor), som tidligere vist7. Hvis det ønskes, kan variationerne mellem replikaterne overvindes ved 1) ved hjælp af optøede PbMs fra samme donor eller 2) pooling PbMs fra forskellige donorer før indefrysning af cellerne, derefter efterfølgende brug af den samme pulje i hver gentagelse. Det anbefales også at inkludere flere biologiske gentagelser.
Cellefrysningsteknikken kan betragtes som et kritisk skridt; Det er dog en fælles laboratorieprocedure til konservering af celler til fænotopypisk og funktionel analyse. Forskellige undersøgelser har vist, at kvaliteten af frosne PbMs er afgørende for deres overlevelse, og en passende frysning teknik er nøglen til succes for efterfølgende analyser med de samme celler28,32. Ændring af protokollen kan udføres ved at fryse PbMs, hvilket giver fleksibilitet i den eksperimentelle opsætning, da tilgængeligheden af buffy frakker er normalt begrænset. En anden fordel ved at bruge frosne PbMs (i flere hætteglas) over frisk isolerede dem er, at de kan bruges i efterfølgende eksperimenter, selv efter 1 år. Dette mindsker det potentielle problem med afvigelser fra donor til donor, hvis dette er en ønsket eller påkrævet parameter i et forsøg.
Resultaterne af en sammenligning mellem laboratoriet, der er foretaget efter op til 13 måneder, viser, at PbM’er, når de opbevares korrekt i en flydende nitrogentank, kan anvendes over en lang periode uden nogen indvirkning på cellernes levedygtighed eller cellegenvinding33. Længere opbevaringstider (over 1 år) kan være mulige ved omhyggelig validering af cellernes levedygtighed og cellerespons, før du udfører et eksperiment. Desuden skal temperaturen i den flydende nitrogentank altid være stabil. Den vigtigste faktor, der påvirkede levedygtigheden af kryobevarede PbM’er, blev anset for at være DMSO-koncentration med en optimal koncentration på 10-20 % (v/v)28. For at minimere de potentielt skadelige virkninger af frysning tilsættes forskellige kilder til proteiner, FBS eller BSA (med en bred vifte af koncentration fra 40% op til 100 %34)ofte til frysemediet som naturlige beskyttende komponenter, der kan øge celleres overlevelsen.
På grund af DMSO’s høje cytotoksiske potentiale anbefales det først at dispergere PBM’er i FBS og derefter tilføje DMSO til PbM’er, der allerede er spredt i FBS. Især selv om højere FBS-koncentrationer (>40%) viste ingen forbedring af cellernes levedygtighed, men de forvolde ikke skade på cellerne28. Ikke desto mindre, frysning monocytter er en mulig tilgang til at overvinde spørgsmål af begrænset buffy pels tilgængelighed. Men hvis brugen af MDDCs og MDM’er fra friske PBM’er ønskes, kan immuncellerne differentieres og anvendes 5-8 dage efter isolation7,,16,,17,,35,36,37. Hvis eksperimentel planlægning tillader det, anbefales det at skelne mindst 6 dage i både MDDC’er og MDM’er. Men konsistens mellem forskellige gentagelser i det samme eksperiment, sammen med rutinemæssige inspektioner af deres specifikke overflade markør udtryk, er afgørende. Reaktionsevnen over for en proinflammatorisk stimulus, såsom LPS, efter differentieringstiden bør også kontrolleres regelmæssigt.
Mange undersøgelser ved hjælp af A549 celle linje er blevet udført på ALI, enten som en monokultur eller kombineret med andre celletyper (makrofager, dendritiske celler, eller fibroblaster) i 3D coculture model22,24,29,38. Ved hjælp af denne 3D-samkulturmodel er cytotoksicitet, oxidativ stress eller proinflammatoriske virkninger af (nano)materialer blevet undersøgt i op til 72 h1,17,21,24,29. Modellens lighed med in vivo væv er tidligere blevet undersøgt baseret på konfokale laserscanning imaging af model16. Ved samling af modellen, er det vigtigt at overveje både celleprolifeion (som kan påvirke A549 i den model, der præsenteres her) samt udførelsen af de primære (ikke prolifererende) immunceller (her, MDDCs og MDM’er). Det er også vigtigt at overveje, at ikke alle CD14 positive monocytter differentierer sig i MDDC’er og MDM’er, og at cellerne kan være til stede i både vedlagte og suspenderede former. Baseret på karakteren af coculture forsamling (her, begge celletyper nødt til at knytte til den eksisterende epitellag), anbefales det kun at bruge den klæbende sub-populationer af begge immuncelletyper. Derudover har rutinemæssige analyser af monocytter, MDDC og MDM monokultur lydhørhed over for LPS, og udtryk for specifikke overflade markører (CD14, CD163, CD86, CD93, eller CD206, data ikke vist) tyder på, at 6 og 7 dages differentiering er de optimale tidspunkter.
Selv om et realistisk antal alveolær epitelceller i humane lunger svarer til ~ 160.000 celler / cm2, er antallet af A549celler,der tælles i modellen ~ 1.000.000 celler /cm2 efter 9 dage dyrket på indsatsen16,18. Således skal denne in vitro-model begrænsninger overvejes. For det første blev tætheden af epitelceller etableret baseret på deres evne til at danne et sammenløbslag på den voksende membran. Det er også vigtigt at nævne, at A549 repræsenterer en epiteltype II-celle med en kuboid form, i modsætning til epiteltype I-celler, som er flade og udspread. På den anden side blev det krævede antal immunceller etableret på grundlag af litteraturen og præsenteret i denne protokol som cellenummer/overfladeområde39,,40,41. Celletætheden af MDDC’er i området 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 kan sammenlignes med den stabile celletæthed på 500-750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) rapporteret fra in vivo-studie39. Tætheden af MDM’er i denne model ligger inden for samme område af in vivo-situationen i den menneskelige alveolær region40.
Ældre makrofag markør farvning (25F9) blev observeret både i den apikale side (hvor MDMs er til stede) samt basal side (dvs. på det sted, hvor dendritiske celler). Translokation af immunceller gennem membranen skær porer er muligt og er også blevet observeret ved hjælp af denne model16, som kan forklare de observerede forskelle i farvning intensiteter. En anden mulig forklaring er dog, at den modne makrofagmarkør også kan udtrykkes på dendritiske celler, men udtrykket er meget donorspecifik42. Desuden er intensiteten af 25F9-udtrykket meget højere i MDMs (Figur 7, Figur 8). Begge proinflammatoriske stimuli (LPS og TNF-α) påvirkede integriteten af lungeepitelbarrieren i begge kokulturer (figur 7, figur 8). Dette var forventet baseret på tidligerepublikationer 43,44 viser,at proinflammatoriske cytokiner og bakterielle produkter forstyrre integriteten af epitelbarrierer.
Den 3D multicellulære model af den menneskelige alveolær epitel, etableret og karakteriserettidligere 17, har fungeret som et kraftfuldt og nyttigt redskab til vurdering af biologiske reaktioner (dvs. akutte proinflammatoriske reaktioner, oxidativstressrespons, partikelfordeling og cellulær kommunikation) in vitro21,24,25,45. Resultaterne bekræfter coculture modellers ansvar for at proinflammatoriske stimuli (her, LPS og TNF-α). Responsen blev lidt øget ved brug af immunceller fra friske PbMs; Der var imidlertid ingen statistisk signifikant forskel mellem cocultures ved hjælp af friske kontra optøede PbMs. Desuden var de proinflammatoriske reaktioner fra begge cokulturmodeller højere end dem, der blev dyrket i epitelcellemonokulturer under de samme (ALI) forhold. Kort sagt beskriver protokollen samlingen af en 3D human alveolær epitelvævskokulturmodel ved hjælp af enten friske eller optøede PbM’er til differentiering i MDMs og MDDCs. Det er vist, at begge modeller er meget lydhøre over for proinflammatoriske stimuli; De kan derfor fungere som effektive redskaber til potentielle risikovurderinger og toksicitetsvurderinger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Miguel Spuch-Golgata for coculture ordningen i figur 3 og til Dr. Bedia Begum Karakocak for kritisk læsning. Denne undersøgelse blev støttet af PATROLS-projektet, DEN Europæiske Unions Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. B.D. takker Peter und Traudl Engelhorn-fonden for økonomisk støtte.
Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
Centrifuge | does not have to be specific | ||
Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
pH meter | does not have to be specific | ||
Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
Scissors | do not have to be specific | ||
Vacuum pump | does not have to be specific | ||
Water bath | does not have to be specific | ||
Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
Cryovials | do not have to be specific | ||
Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
Chemicals | |||
Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
CD14+ MicroBeads human – magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D5879_1L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 31870-025 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 14190-094 | |
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 11875093 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
Immunostaining | |||
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 28718-90-3 | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |