En protokol præsenteres kombinere væv clearing med lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM) for at opnå tre-dimensionelle og cellulære opløsning billeder af lymfekar og lymfeknuder (LNs) indsamle cerebrospinalvæske (CSF) og spinal epidural væske.
Lymfesystemet forbundet med centralnervesystemet (CNS) omfatter lymfe vaskulatur, der spinder rundt i hjernen, rygmarven, og dens tilknyttede LNs. CNS-associeret lymfesystemet er involveret i dræning af CSF makromolekyler og meningeal immunceller mod CNS-drænende LNs, og dermed regulere affald clearance og immunovervågning i CNS væv. Præsenteret er en ny tilgang til at opnå tre-dimensionelle (3D) og cellulære opløsning billeder af CNS-associerede lymfeknuder og samtidig bevare integriteten af deres kredsløb i det omgivende væv. iDISCO+-protokollen anvendes til immunmærkelymfekar i afkalkede og ryddede hele monteringspræparaterne af rygsøjlen, som efterfølgende afbildes med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). Teknikken afslører 3D-strukturen af lymfenetværket, der forbinder meningeal og epidural rum omkring rygmarven til extravertebral lymfekar. Forudsat er 3D-billeder af dræning kredsløb af molekylære sporstoffer tidligere injiceres i enten CSF via cisterna magna eller thoracolumbar spinal parenkym. IDISCO+/LSFM-tilgangen giver hidtil usete muligheder for at udforske strukturen og funktionen af det CNS-associerede lymfesystem i neurovaskulær biologi, neuroimmunologi, hjerne- og ryghvirvlingekræft eller vertebrale knogler og ledbiologi.
CNS er omgivet af CSF og overliggende lag af meninges, epidural væv, og knogler. Alt i alt giver CSF fysisk beskyttelse til den bløde hjerne og rygmarv. Det er hovedsageligt udskilles af choroid plexus og meningeal membraner (dvs. pia mater, arachnoid, og dura mater). CSF-meningeal-komplekset etablerer også en funktionel grænseflade mellem CNS-væv og resten af kroppen og bidrager dermed til CNS-homøostase. For det første, CSFtrænger CNS parenkym gennem CNS para-arterielle rum og interagerer dynamisk med den interstitielle væske (ISF) 1 via glymphatic (glialymfe) system, som består af paravascular rum og astrocyt end-feet membraner omkring CNS fartøjer2,,3,4. Metabolisk affald og overskydende væske er derefter i sidste ende ryddet af intramural perivascular dræning direkte fra hjernen parenkym mod den systemiskecirkulation 3, samt de paravenøse rum mod CSF og via hjerne-drænende lymfekar, i henhold til glymphatic model2,4. CSF-udstrømningen sker hovedsagelig via lymfesystemet gennem krympepladen og tilhørende ekstrakraniskelymfekar 5,6,7samt af de meningeale lymfekar, der konvergerer ved de hjernedrænende LNs8,9,10,11,12 (Figur 1). En vigtig, selv om sekundær, rolle i CSF udstrømning er taget af kraniel arachnoid villi, som trænger ind i lakunen af meningeal venøse bihuler13.
CFS-dræningskredsløbene er blevet grundigt undersøgt gennem eksperimentelle tilgange baseret på injektion af farvede/fluorescerende lymstoffer i CNS eller CSF, efterfulgt af billeddannelse af sporstoffers mønster inde i CNS og i hele kroppens organer og væv på forskellige tidspunkter efter injektion13. I lang tid, udstrømningen af CSF blev anset for at være udelukkende og direkte taget ansvaret af blodcirkulationen, gennem arachnoid villi projicere i dural venøse bihuler13. Csf udstrømningen udføres dog overvejende af lymfevaskulaturen, som det for nylig fremgår af nær-infrarød (NIR) dynamisk billeddannelse af CSF-injiceret sporstoftransport i mus9,10. CSF-drænende lymfekar derefter vende tilbage lymfeknuder til blodbanen via højre subclavia vene. Komplementære approches har opdaget både ekstrakranial6,,7,,13 og intrakraniel9,,10,,11,,12 lymfeudgange af CSF-injicerede sporstoffer og tyder på, at CSF absorberes af to lymfeveje, den ene eksterne og den anden interne til rygsøjlen og rygsøjlen. Den vigtigste del af CSF dræning hurtigt opstår gennem lymfekar placeret rostrally, uden for kraniet i næseslimhinden, gennem kanaler af cribriform plade af ethmoidknoglen 3,6,13 og, caudally, uden for lumbosacral vertebrale knogler gennem dorsolaterale ruter, der endnu ikke er fuldt karakteriseret7,14. Desuden, i meninges af kraniet, lymfe kapillærer af dura mater directy absorbere CSF og meningeal immunceller mod dural lymfesamlere, der krydser kraniet knogler og forbinde til CNS-drænende LNs12,14. Disse meningeal lymfekar spiller vigtige roller i CNS patofysiologi, fordi hjernen meningeal lymfe er ændret ved aldring og også påvirke resultatet af neurologiske hjernesygdomme, herunder neurodegeneration, neuroinflammation, og hjernekræft15,16,17. Derfor kan CNS-associeret lymfevaskulatur (dvs. dural og perifere lymfekar dræne CSF) være et lovende nyt mål for at bekæmpe CNS-sygdomme hos mennesker.
Konvergerende undersøgelser udført med immunohistologi og højopløsningsmagdannelse af magnetisk resonans viste, at meningeal lymfekonfekturen også findes hos primater, herunder almindelige marmoseaber og mennesker7,11,13. Desuden meningeal lymfekar er ikke begrænset til kraniet, men strækker sig inden for rygsøjlen til overfladen af spinal ganglier og rami13,18. Tre-dimensionelle (3D) billeddannelse af rygsøjlen lymfeknuder bevare den overordnede anatomi af mærket vertebrale og spinal prøver, herunder overliggende knogler, muskler, ledbånd, samt tilstødende viscerale væv, blev for nylig udført14. iDISCO+ protokol19,20 blev anvendt til at afkalke og rense præparater af hele rygsøjlen med lymfespecifikke antistoffer mod enten membranreceptoren LYVE121 eller transskriptionsfaktoren PROX122. Billederhvervelse og analyse blev derefter udført med lysark fluorescensmikroskopi (LSFM) og Imaris software. LSFM giver mulighed for hurtig og minimalt invasiv 3D-billeddannelse af store prøver ved aksial indeslutning af belysning, hvilket resulterer i reduceret fotobleaching og fototoksicitet23.
IDISCO+/LSFM tilgang giver karakterisering af de forskellige lag af dural og epidural lymfekar, og forbindelsen af denne vaskulatur til extravertebral lymfekredsløb og LNs tilstødende rygsøjlen. Protokollen blev anvendt på væv, der tidligere blev injiceret med fluorescerende sporstoffer for at påvise dræning af rygsøjlen. Dette papir indeholder oplysninger om iDISCO+/ LSFM metode til billede af vertebrale lymfedrænulatur og illustrerer dens relevans for CSF og epidural væske dræning undersøgelse.
iDISCO+/LSFM-protokollen giver hidtil usete 3D-visninger af det CNS-tilknyttede lymfenetværk i det omgivende væv på celleopløsningsniveau. Denne protokol er godt tilpasset til mellemstore prøver, ikke exeeding 1,5 cm3,på grund af begrænsningerne i LSFM optiske system, den reducerede arbejdsafstand, og den store størrelse af kommercielle mål linser til høj opløsning mikroskopi23. Denne begrænsning forhindrer opfange hele hjerne-associerede lymfesystem. Det er vigtigt at bemærke, at undersøgelsesområdet skal afgrænses forsigtigt, og at vævene omkring CNS skal dissekeres omhyggeligt for at omfatte de ekstrakranielle lymfekar og MF’er, der bidrager til hele lymfekredsløbet (tabel 2).
Ud over størrelse og anatomiske overvejelser varierer kompleksiteten af omgivende mesenkymale væv langs kraniet og rygsøjlen, hvilket kræver tilpasning af afkalkning og forafklaringsbehandling for at opnå en homogen prøveafklaring og tillade lysstråleformering i et blødt isotropisk biologisk væv. I mangel af knogler, LFSM billeddannelse af hjernen eller rygmarvsvæv ikke nødvendiggør afkalkning trin, og den endelige opløsning af de optagne billeder er optimal19. Den ovenfor beskrevne protokol, som omfatter et mildt afkalkningstrin med Morses opløsning, er godt tilpasset til LSFM-billeddannelse af rygsøjlen som vist i figur 1 og figur 4. I modsætning hertil halsregionen viser en særlig kompleks knogle anatomi ud over flere lag af muskler, fedt og kirtelvæv, som reducerer kvaliteten af tilfangetagne LSFM billeder, som afspejles i figur 3B. LSFM-billeddannelse i hals- og livmoderhalsområdet kan således forbedres ved en strengere behandling af væv; f.eks. med EDTA, som tidligere rapporteret24. Afkalkningstrinnet er derfor kritisk, og afkalkningsbetingelserne skal tidligere testes for hvert anvendte antistof, før den fulde iDISCO+ protokol ( tabel 2 )påbegyndes.
Mens iDISCO+/LSFM-protokollen giver mulighed for at oprette en 3D-visning af forbindelseskredsløb mellem meningeal- og epiduralrum og tilhørende LN’er, den direkte kvantitative analyse af lymfekrululaturen fra LSFM-taget billeder er ikke mulig af følgende grunde: 1) afgrænsning af lymfekarkredsløb er upålidelig på grund af det diskontinuerlige mønster af lymfemarkørudtryk, fordi membranærvely 1 er hereterogentfordelt 21 og PROX1 har et nukleart udtryksmønster22 2) den heterogene indtrængen af antistoffer, samt anisotropi, der kan vare ved i det biologiske væv på grund af ufuldstændig og heterogen afkalkning og preclearing. LSFM-billeddannelse skal derfor udvides med virtual reality-værktøjer, der muliggør interaktiv visualisering og dermed letter kvantificeringen af lymfevaskulaturen (www.syglass.io). Det er også bemærkelsesværdigt, at den præcise beskrivelse af det CNS-tilknyttede kredsløb kræver sikkerhedskopiering af LSFM-oplysninger med konfokale højopløsningsdata, der er opnået ved konventionel immunmærkning på tynde (5-10 μm) kryostat eller paraffininddene vævssektioner, især for præcist at lokalisere lymfebeholdernes position med hensyn til dura mater og CSF, som tidligererapporteret 11,14,18.
IDISCO+/LSFM-protokollen giver mulighed for tredimensionel visualisering af makromolekylær dræning i det CNS-tilknyttede lymfesystem, som vist i figur 3 og figur 4. Den funktionelle vurdering af lymfedrænage kræver imidlertid ud over anbefalingerne til ovennævnte iDISCO+/LSFM-protokol efter en streng procedure, da det endelige resultat afhænger af kvaliteten af injektionskirurgien, valget af leveringsstedet, typen og den injicerede mængde af den anvendte makromolekylemarkør og tidspunktet for ofringen efter sporingsadministration (tabel 2). På grund af variationer i spormønsteret mellem indsprøjtede dyr kræver karakteriseringen af lymfedrænagekredsløb store forsøgsgrupper (>10 ved injektionstilstand). I den fremlagte protokol skal dura-materen punkteres før injektion for at forhindre uønskede læsioner og indtrængning i CNS-vævene. 2) det injicerede volumen skal være mindre end 2 μL for at begrænse uønsket diffusion gennem injektionshullet langs injektionskapillæren ind i epiduralrummet eller ekstravertebralt væv; 3) dybheden af injektion kapillær indsættelse skal begrænses til 2 mm under dura mater for at undgå CNS skade eller mistargeting i ICM og intraspinal injektioner, henholdsvis. Bemærk også, at en supplerende konfokal analyse af tilstødende vertebrale segmenter, som angivet ovenfor, skal udføres for at vurdere tilstedeværelsen af injiceret sporstof inde i lymfekar. Denne analyse kræver, at der fastlægges intensitetsprofilområder for sporstof og lymfemarkør på tværsnit af markørmærkede lymfekar. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at påvise OVA555 optagelse af ThLb lymfeknuder på 15 min efter injektion (supplerende figur 5F i Jacob et al.14). Det er dog ikke illustreret for anti-LYVE1-sporstof i denne undersøgelse (figur 4).
Blandt mulige CSF-sporstoffer er OVA-A555 en glimrende mulighed, da det er modstandsdygtigt over for iDISCO+ protokolbehandlinger og opretholder høj fluorescens for LSFM-billeddannelse. Bemærk dog, at type sporstoftypen skal vælges i overensstemmelse med analysetidspunktet (tabel 1 og tabel 2) . Som rapporteret ovenfor observeres OVA-A555 mærkning af lokale vertebrale lymfekar ved 15 min efter injektion14. OVA-A555 påvises dog ikke længere i disse lokale lymfekredsløb ved 45 min efter injektion (Figur 3) i modsætning til anti-LYVE1 antistoffet (Figur 4).
Afslutningsvis er iDISCO+/LSFM-protokollen godt tilpasset til undersøgelse af 3D-strukturen og dræningen af det CNS-associerede lymfesystem under fysiologiske og patologiske forhold såsom CNS- og vertebrale kolonnekræft eller vertebrale knogle- og ledsygdomme. Selv om den fulde procedure er lang og kræver metodologisk stringens, det giver værdifulde, unikke oplysninger, når de anvendes med supplerende analyse ved hjælp af virtual reality-værktøjer og høj opløsning konfokale billeddannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Moduration (til L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ for J.B.), NIH (R01EB016629-01) og Yale School of Medicine. Vi anerkender ICM platforme: ICM-QUANT for cellulære billedbehandling og ICM-histomics for immunohistochemistry. Alt dyrearbejde blev udført på PHENO-ICMice-anlægget. Kernen understøttes af 2 “Investissements d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 og ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) og “Fondation pour la Recherche Médicale”. Vi anerkender Nicolas Renier for metodologisk rådgivning og manuskriptlæsning.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |