Ein Protokoll wird vorgestellt, das gewebeclearing mit Derobogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) kombiniert, um dreidimensionale und zelluläre Auflösungsbilder der Lymphgefäße und Lymphknoten (LNs) zu erhalten, die die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und die spinale Epiduralanflüssigkeit sammeln.
Das lymphatische System, das mit dem zentralen Nervensystem (ZNS) assoziiert ist, umfasst die lymphatische Vaskulatur, die sich um das Gehirn, das Rückenmark und die zugehörigen LNs dreht. Das ZNS-assoziierte Lymphsystem ist an der Drainage von CSF-Makromolekülen und meningenalen Immunzellen in ZNS-entwässernde LNs beteiligt, wodurch die Abfallabfertigung und Immunüberwachung innerhalb von ZNS-Geweben reguliert wird. Präsentiert wird ein neuartiger Ansatz, um dreidimensionale (3D) und zelluläre Auflösungsbilder von ZNS-assoziierten Lymphatten zu erhalten und gleichzeitig die Integrität ihrer Schaltkreise innerhalb des umgebenden Gewebes zu erhalten. Das iDISCO+ Protokoll wird verwendet, um lymphatische Gefäße in entkalkten und gereinigten ganzen Mount-Präparaten der Wirbelsäule zu immunisieren, die anschließend mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) abgebildet werden. Die Technik zeigt die 3D-Struktur des lymphatischen Netzwerks, das die Meningeal- und Epiduralräume um das Rückenmark mit extravertebralen Lymphgefäßen verbindet. Zur Verfügung gestellt werden 3D-Bilder der Drainagekreise von molekularen Tracern, die zuvor entweder über die Zisterne magna oder das Thorakolumbar-Spinalparenchym in das CSF injiziert wurden. Der iDISCO+/LSFM-Ansatz bietet beispiellose Möglichkeiten, die Struktur und Funktion des ZNS-assoziierten Lymphsystems in der neurovaskulären Biologie, Neuroimmunologie, Hirn- und Wirbelkrebs oder Wirbelknochen- und Gelenkbiologie zu erforschen.
Das ZNS ist von dem CSF umgeben und überlagert Schichten von Meningen, Epiduralgewebe und Knochen. Insgesamt bietet das CSF physischen Schutz für das weiche Gehirn und das Rückenmark. Es wird hauptsächlich durch den Aderhautplexus und die Meningealmembranen (d.h. die Pia mater, das Arachnoid und die Dura mater) abgesondert. Der CSF-Meningealkomplex schafft auch eine funktionelle Schnittstelle zwischen dem ZNS-Gewebe und dem Rest des Körpers und trägt so zur ZNS-Homöostase bei. Zunächst dringt das CSF durch das CNS-Parenchym durch die Paraarterienräume des ZNS und interagiert dynamisch mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF)1 über das glymphatische (glia-lymphatische) System, das aus den paravaskulären Räumen und den Astrozyten-Endfüßen um die CNS-Gefäße2,3,4besteht. Stoffwechselabfälle und überschüssige Flüssigkeit werden dann letztlich durch intramurale perivaskuläre Drainage direkt aus dem Hirnparenchym in Richtung des systemischen Kreislaufs3, sowie die paravenösen Räume in Richtung DES CSF und über Brain-Draining Lymphgefäße, nach dem glymphatischen Modell2,4. Der CSF-Abfluss erfolgt hauptsächlich über das Lymphsystem, durch die Cribriform-Platte und die damit verbundenen extrakraniellen Lymphgefäße5,6,7, sowie durch die meningealen Lymphgefäße, die an den Braindraining LNskonvergieren 8,9,10,11,12 ( Abbildung1). Eine wichtige, wenn auch sekundäre Rolle im CSF-Abfluss spielt die Schädelarachnoid-Zotten, die in die Lücke der meningealvenösen Nebenhöhlen eindringen13.
Die CFS-Drainagekreise wurden durch experimentelle Ansätze, die auf der Injektion von farbigen/fluoreszierenden Tracern in das ZNS oder CSF basierten, ausgiebig untersucht, gefolgt von der Abbildung des Musters der Tracer im ZNS und in den gesamten Organen und Geweben des Körpers zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion13. Lange Zeit galt der Abfluss von CSF als ausschließlich und direkt von der Durchblutung übernommen, durch Arachnoidezotten, die in durale venöse Nebenhöhlen projiziert wurden13. Allerdings wird der CSF-Abfluss überwiegend durch die lymphatische Vaskulatur durchgeführt, wie kürzlich durch die dynamische Nahinfrarot-Bildgebung (NIR) des CSF-injizierten Tracertransports bei Mäusen9,10gezeigt wurde. Die CSF-entwässernden Lymphgefäße kehren dann über die rechte subklavische Vene in den Blutkreislauf zurück. Ergänzende Approchen haben sowohl extrakranielle6,7,13 als auch intrakranielle9,10,11,12 lymphatische Ausgänge von CSF-injizierten Tracern nachgewiesen und deuten darauf hin, dass das CSF von zwei lymphatischen Bahnen absorbiert wird, einer extern erund der andere innerhalb der Schädel- und Wirbelsäule. Der Hauptteil der CSF-Drainage tritt schnell durch lymphatische Gefäße rostral, außerhalb des Schädels in der Nasenschleimhaut, durch Kanäle der cribriformen Platte des Ethmoidknochens3,6,13 und, kauarisch, außerhalb von lumbosakralen Wirbelknochen durch dorsolaterale Routen, die noch nicht vollständig charakterisiert sind7,14. Darüber hinaus absorbieren lymphatische Kapillaren der Dura mater in den Hirnhäuten des Schädels direkt CSF- und Meningeal-Immunzellen in Richtung duraler Lymphkollektoren, die die Schädelknochen kreuzen und sich mit ZNS-entwässernden LNs12,14verbinden. Diese meningealen Lymphgefäße spielen eine wichtige Rolle in der ZNS Pathophysiologie, weil Gehirn Meningeal-Lymphatik enden nach dem Altern verändert und auch das Ergebnis von neurologischen Gehirnerkrankungen beeinflussen, einschließlich Neurodegeneration, Neuroinflammation, und Hirntumor15,16,17. Daher kann die CNS-assoziierte lymphatische Vaskulatur (d. h. die duralen und peripheren Lymphgefäße, die das CSF entwässern) ein vielversprechendes neues Ziel zur Bekämpfung von ZNS-Erkrankungen beim Menschen sein.
Konvergente Studien, die mit Immunohistologie und hochauflösender Magnetresonanztomographie durchgeführt wurden, zeigten, dass die meningeale lymphatische Vaskulatur auch bei Primaten existiert, einschließlich gemeinsamer Marmosetaffen und Menschen7,11,13. Darüber hinaus sind meningeale Lymphgefäße nicht auf den Schädel beschränkt, sondern erstrecken sich innerhalb der Wirbelsäule bis zur Oberfläche von Spinalganglien und Rami13,18. Dreidimensionale (3D) Bildgebung der WirbelsäuleLymphatik, die die allgemeine Anatomie der markierten Wirbel- und Wirbelsäulenproben, einschließlich überlegender Knochen, Muskeln, Bänder, sowie benachbarteviszeraler Gewebe, bewahrt, wurde vor kurzemdurchgeführt 14. Das iDISCO+ Protokoll19,20 wurde verwendet, um entkalkte und gelöschte Präparate der gesamten Wirbelsäule mit lymphatischen spezifischen Antikörpern entweder gegen den Membranrezeptor LYVE121 oder den Transkriptionsfaktor PROX122zu immunlabelieren. Anschließend wurden bildkundigte Mikroskopie (LSFM) und die Imaris-Software mit Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) und der Software Imaris erfasst und analysiert. LSFM ermöglicht eine schnelle und minimalinvasive 3D-Bildgebung großer Proben durch axiale Einschließung der Beleuchtung, was zu einer reduzierten Photobleaching und Phototoxizitätführt 23.
Der iDISCO+/LSFM-Ansatz ermöglicht die Charakterisierung der unterschiedlichen Schichten von duralen und epiduralischen Lymphgefäßen und die Verbindung dieser Vaskulatur mit den extravertebralen Lymphkreisen und den LNs, die die Wirbelsäule benachbarten. Das Protokoll wurde auf Gewebe angewendet, die zuvor mit fluoreszierenden Tracern injiziert wurden, um die Wirbelkanalentwässerung zu demonstrieren. Das vorliegende Papier enthält Einzelheiten zur iDISCO+/LSFM-Methodik zur Abbildung der wirbellichen Lymphvaskulatur und veranschaulicht deren Relevanz für die Untersuchung der CSF- und Epiduralflüssigkeitsdrainage.
Das iDISCO+/LSFM-Protokoll bietet beispiellose 3D-Ansichten des CNS-assoziierten Lymphnetzes innerhalb seiner umgebenden Gewebe auf zellulärer Auflösungsebene. Dieses Protokoll ist gut an mittelgroße Proben angepasst, nicht exeeding 1,5 cm3, aufgrund der Einschränkungen des LSFM optischen Systems, der verringerte Arbeitsabstand, und die große Größe der kommerziellen Objektive für hochauflösende Mikroskopie23. Diese Einschränkung verhindert die Erfassung des gesamten gehirnassoziierten Lymphsystems. Es ist wichtig zu beachten, dass der Untersuchungsbereich vorsichtig abgegrenzt und das Gewebe, das das ZNS umgibt, sorgfältig seziert werden muss, um die extrakraniellen Lymphgefäße und LNs einzubeziehen, die zur gesamten Lymphschaltung beitragen (Tabelle 2).
Neben Der Größe und den anatomischen Überlegungen variiert die Komplexität der umgebenden mesenchymalen Gewebe entlang des Schädels und der Wirbelsäule, was eine Anpassung der Entkalkungs- und Vorklärungsbehandlung erfordert, um eine homogene Probenklärung zu erhalten und eine Lichtstrahlvermehrung innerhalb eines weichen isotropen biologischen Gewebes zu ermöglichen. In Ermangelung von Knochen erfordert die LFSM-Bildgebung des Gehirns oder des Rückenmarksgewebes keinen Entkalkungsschritt, und die endgültige Auflösung der aufgenommenen Bilder ist optimal19. Das oben beschriebene Protokoll, das einen leichten Entkalkungsschritt mit Morse-Lösung beinhaltet, ist gut für die LSFM-Bildgebung der Wirbelsäule geeignet, wie in Abbildung 1 und Abbildung 4dargestellt. Im Gegensatz dazu zeigt der Halsbereich eine besonders komplexe Knochenanatomie zusätzlich zu mehreren Schichten von Muskeln, Fett und Drüsengeweben, die die Qualität der erfassten LSFM-Bilder reduzieren, wie in Abbildung 3Bwidergespiegelt. Die LSFM-Bildgebung des Hals- und Gebärmutterhalsbereichs kann somit durch eine strengere Behandlung von Geweben verbessert werden; z. B. mit EDTA, wie bereits berichtet24. Der Entkalkungsschritt ist daher kritisch und die Entkalkungsbedingungen müssen zuvor für jeden verwendeten Antikörper getestet werden, bevor das vollständige iDISCO+ Protokoll (Tabelle 2) gestartet wird.
Während das iDISCO+/LSFM-Protokoll die Erzeugung einer 3D-Ansicht von Verbindungskreisen zwischen den meningealen und epidururalen Räumen und den zugehörigen LNs ermöglicht, die direkte quantitative Analyse der lymphatischen Vaskulatur aus LSFM-gefangenen Bildern ist aus folgenden Gründen nicht möglich: 1) Die Abgrenzung von Lymphgefäßkreisen ist aufgrund des diskontinuierlichen Musters der lymphatischen Markerexpression unzuverlässig, da membranar LYVE1 hierterogen verteilt ist21 und PROX1 ein Kernexpressionsmuster22aufweist; 2) das heterogene Eindringen von Antikörpern sowie die Anisotropie, die aufgrund unvollständiger und heterogener Entkalkung und Vorklärung im biologischen Gewebe fortbestehen kann. Die LSFM-Bildgebung muss daher um Virtual-Reality-Tools erweitert werden, die eine interaktive Visualisierung ermöglichen und so die Quantifizierung der lymphatischen Vaskulatur (www.syglass.io) erleichtern. Bemerkenswert ist auch, daß die genaue Beschreibung der CNS-assoziierten Schaltungen die Sicherung von LSFM-Informationen mit hochauflösenden konfokalen Daten erfordert, die durch konventionelle Immunkennzeichnung auf dünnen (5–10 m) Kryostat- oder Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten gewonnen werden, insbesondere um die Position der Lymphgefäße in Bezug auf den Dura mater und das CSF genau zu lokalisieren, wie zuvor berichtet11,14,18.
Das Protokoll iDISCO+/LSFM ermöglicht eine dreidimensionale Visualisierung der makromolekularen Drainage im ZNS-assoziierten Lymphsystem, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt. Die funktionelle Beurteilung der Lymphdrainage erfordert jedoch zusätzlich zu den oben beschriebenen Empfehlungen zum iDISCO+/LSFM-Protokoll nach einem strengen Verfahren, da das Endergebnis von der Qualität der Injektionschirurgie, der Wahl der Abgabestelle, der Art und dem injizierten Volumen des verwendeten Makromolekülmarkers und der Zeit des Opfers nach der Verabreichung von Tracer abhängt (Tabelle 2). Aufgrund von Variationen des Tracermusters zwischen injizierten Tieren erfordert die Charakterisierung von Lymphdrainagekreisläufen große Versuchsgruppen (>10 durch Injektionsbedingung). In dem vorgestellten Protokoll 1) muss die Dura mater vor der Injektion punktiert werden, um unerwünschte Läsionen und das Eindringen in das ZNS-Gewebe zu verhindern; 2) das injizierte Volumen muss weniger als 2 l betragen, um die unerwünschte Diffusion durch das Injektionsloch entlang der Injektionskapillare in den Epiduralraum oder das extravertebrale Gewebe zu begrenzen; 3) Die Tiefe der Injektionkapillarinsertion muss auf 2 mm unter der Dura mater begrenzt werden, um ZNS-Verletzungen bzw. Fehltargeting bei ICM- bzw. Intraspinalinjektionen zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass eine komplementäre hochauflösende konfokale Analyse benachbarter Wirbelsegmente durchgeführt werden muss, wie oben angegeben, um das Vorhandensein eines injizierten Tracers innerhalb der Lymphgefäße zu bewerten. Diese Analyse erfordert die Ermittlung der Intensitätsprofildiagramme für den Tracer und den Lymphmarker auf Querschnitten von markermarkierten Lymphgefäßen. Dieser Ansatz wurde zuvor verwendet, um die OVA555-Aufnahme durch ThLb-Lymphatik enden zu können, 15 min nach der Injektion (Supplementary Figure 5F in Jacob et al.14). Für den Anti-LYVE1-Tracer wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht gezeigt (Abbildung 4).
Unter den möglichen CSF-Tracern ist OVA-A555 eine ausgezeichnete Option, da es gegen die iDISCO+ Protokollbehandlungen resistent ist und eine hohe Fluoreszenz für die LSFM-Bildgebung beibehält. Beachten Sie jedoch, dass der Spurensicherungstyp gemäß dem Analysezeitpunkt (Tabelle 1 und Tabelle 2) ausgewählt werdenmuss. Wie bereits erwähnt, wird die OVA-A555-Kennzeichnung lokaler Wirbellymphgefäße nach 15 min nach Injektion14beobachtet. ALLERDINGS wird OVA-A555 in diesen lokalen Lymphkreisläufen nach 45 min nach der Injektion nicht mehr nachgewiesen (Abbildung 3) im Gegensatz zum Anti-LYVE1-Antikörper (Abbildung 4).
Abschließend möchte ich sagen, dass das iDISCO+/LSFM-Protokoll gut für die Untersuchung der 3D-Struktur und Drainage des ZNS-assoziierten Lymphsystems unter physiologischen und pathologischen Bedingungen wie ZNS- und Wirbelsäulenkrebs oder Wirbelknochen- und Gelenkerkrankungen geeignet ist. Obwohl das gesamte Verfahren lang ist und methodische Strenge erfordert, liefert es wertvolle, einzigartige Informationen, wenn es mit komplementärer Analyse mit Virtual-Reality-Tools und hochauflösender konfokaler Bildgebung verwendet wird.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (to L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ for J.B.), NIH (R01EB016629-01) und yale School of Medicine. Wir würdigen die ICM-Plattformen: ICM-QUANT für zelluläre Bildgebung und ICM-Histomik für die Immunhistochemie. Alle Tierarbeiten wurden in der PHENO-ICMice-Anlage durchgeführt. Der Kern wird unterstützt durch 2 “Investissements d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 und ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) und die “Fondation pour la Recherche Médicale”. Wir würdigen Nicolas Renier für methodische Beratung und Manuskriptlektüre.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |