एक प्रोटोकॉल प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (LSFM) के साथ ऊतक समाशोधन के संयोजन के लिए लिम्फेटिक जहाजों और लिम्फ नोड्स (एलएनएस) के तीन आयामी और सेलुलर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जो सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (सीएसएफ) और रीढ़ की हड्डी में द्रवण का संग्रह करता है।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली में मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और उससे जुड़े एलएन के आसपास स्पिन करने वाला लिम्फेटिक वैक्यूलेचर शामिल है। सीएनएस से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली सीएनएस-ड्रेनिंग एलएन की ओर सीएसएफ मैक्रोमॉलिक्यूल्स और मेनिंगियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जल निकासी में शामिल है, जिससे सीएनएस ऊतकों के भीतर अपशिष्ट निकासी और प्रतिरक्षा निगरानी को विनियमित किया जाता है। प्रस्तुत किया गया एक उपन्यास दृष्टिकोण है जो आसपास के ऊतकों के भीतर अपने सर्किट की अखंडता को संरक्षित करते हुए सीएनएस से जुड़े लिम्फाटिक्स के त्रि-आयामी (3 डी) और सेलुलर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए है। iDISCO+ प्रोटोकॉल का उपयोग डिक्लेस्काइड में लिम्फेटिक जहाजों को इम्यूनोलेबल करने के लिए किया जाता है और कशेरुकी स्तंभ की पूरी माउंट तैयारी को मंजूरी दे दी जाती है जिसे बाद में प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के साथ चित्रित किया जाता है। इस तकनीक से रीढ़ की हड्डी के चारों ओर मेनिंगियल और एपिड्यूरल रिक्त स्थान को बाहरी लिम्फेटिक जहाजों से जोड़ने वाले लिम्फेटिक नेटवर्क की 3डी संरचना का पता चलता है । बशर्ते आणविक ट्रेसर्स के ड्रेनेज सर्किट की 3डी छवियां पहले सिस्टर्ना मैग्ना या थोराकोलंबर स्पाइनल पैरान्चिमा के माध्यम से सीएसएफ में इंजेक्ट की गई हों। iDISCO+/LSFM दृष्टिकोण न्यूरोवैस्कुलर जीव विज्ञान, न्यूरोइम्यूनोलॉजी, मस्तिष्क और कशेरुकी कैंसर, या कशेरुकी हड्डी और संयुक्त जीव विज्ञान में सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक सिस्टम की संरचना और कार्य का पता लगाने के लिए अभूतपूर्व अवसर लाता है ।
सीएनएस सीएसएफ से घिरा हुआ है और मेनिंग्स, एपीड्यूरल ऊतक और हड्डियों की परतों को ओवरलेइंग करता है। कुल मिलाकर, सीएसएफ नरम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को शारीरिक सुरक्षा प्रदान करता है। यह मुख्य रूप से कोरॉइड प्लेक्सस और मेनिंगियल झिल्ली (यानी, पिया मेटर, आरेक्नोइड, और ड्यूरा मेटर) द्वारा स्रावित किया जाता है। सीएसएफ-मेनिंगियल कॉम्प्लेक्स सीएनएस ऊतकों और शरीर के बाकी हिस्सों के बीच एक कार्यात्मक इंटरफेस भी स्थापित करता है, जिससे सीएनएस हो्योस्टेसिस में योगदान होता है। सबसे पहले, सीएसएफ सीएनएस पैरा-धमनी रिक्त स्थान के माध्यम से सीएनएस पैरान्चिमा में प्रवेश करता है और ग्लाइम्फेटिक (ग्लिया-लिम्फेटिक) प्रणाली के माध्यम से इंटरस्टिशियल द्रव (आईएसएफ)1 के साथ गतिशील रूप से बातचीत करता है,,जिसमें सीएनएस जहाजों2,3,4के आसपास पैरास्कुलर रिक्त स्थान और एस्ट्रोसाइट एंड-फीट झिल्ली शामिल हैं।, मेटाबोलिक अपशिष्ट और अतिरिक्त तरल पदार्थ को अंततः मस्तिष्क परृन्चिमा से सीधे प्रणालीगत परिसंचरण3की ओर इंट्राम्यूरल पेरिवासुलर ड्रेनेज द्वारा मंजूरी दी जाती है, साथ ही सीएसएफ की ओर पैरावेनस रिक्त स्थान और मस्तिष्क-सूखा लिम्फेटिक जहाजों के माध्यम से, ग्लाम्फेटिक मॉडल2,,4के अनुसार। सीएसएफ बहिर्वाह मुख्य रूप से लिब्रिकेट सिस्टम के माध्यम से, क्रिब्रिफॉर्म प्लेट और संबद्ध एक्सट्राक्रैनियल लिम्फेटिक जहाजों5,,6, 7के7साथ-साथ मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाजों द्वारा होता है, जो मस्तिष्क-निकासी वाले एलएनएस8,,9,10,,,11,,12 (चित्रा 1)पर एकाग्र होते हैं। सीएसएफ आउटफ्लो में एक महत्वपूर्ण, हालांकि माध्यमिक भूमिका कपाल आरेक्नोइड विली द्वारा ली जाती है, जो मेनिंगियल वेनस साइनस13की कमी को भेदती है।
सीएनएस या सीएसएफ में रंगीन/फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स के इंजेक्शन के आधार पर प्रायोगिक दृष्टिकोणों के माध्यम से सीएफएस ड्रेनेज सर्किट की बड़े पैमाने पर जांच की गई है, जिसके बाद सीएनएस के अंदर ट्रेसर्स पैटर्न की इमेजिंग और इंजेक्शन13के बाद विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर शरीर के अंगों और ऊतकों में । लंबे समय तक, सीएसएफ के बहिर्वाह को विशेष रूप से माना जाता था और सीधे रक्त परिसंचरण द्वारा प्रभारी माना जाता था, आरेक्नोइड विली के माध्यम से ड्यूरल वेनस साइनस13में पेश किया गया था। हालांकि, सीएसएफ बहिर्वाह मुख्य रूप से लिम्फेटिक वाक्यूलेचर द्वारा किया जाता है, जैसा कि हाल ही में चूहों9,,10में सीएसएफ-इंजेक्शन ट्रेसर परिवहन के निकट-अवरक्त (एनआईआर) गतिशील इमेजिंग द्वारा दिखाया गया है। सीएसएफ-ड्रेनिंग लिम्फेटिक वाहिकाएं फिर सही सबक्लेवियन नस के माध्यम से खून में लिम्फ वापस करते हैं । ,पूरक अनुमानों ने सीएसएफ-इंजेक्शन ट्रेसर्स के दोनों एक्सट्राक्रैनियल6,,7,,13 और इंट्राक्रैनियल9,,10,11,,12 लिम्फेटिक रास्ते का पता लगाया है और सुझाव दिया है कि सीएसएफ दो लिम्फेटिक रास्तों, एक बाहरी और खोपड़ी औरवर्टेब्रल कॉलम के लिए आंतरिक एक द्वारा अवशोषित किया जाता है। सीएसएफ जल निकासी का मुख्य हिस्सा तेजी से नाक म्यूकोसा में खोपड़ी के बाहर,,एथिमॉइड हड्डी 3,6,,13के क्रिब्रिफॉर्म प्लेट के माध्यम से, लिम्फेटिक जहाजों के माध्यम से होता है और, कोडाली, डोरसोलेटरल मार्गों के माध्यम से लुम्बोसाक्राल कशेरुकी हड्डियों के बाहर, जो अभी तक पूरी तरह से13 7,,14की विशेषता नहीं है। इसके अलावा, खोपड़ी के मेनिंग्स में, ड्यूरा मेटर डायरेक्टी की लिम्फेटिक केशिकाएं सीएसएफ और मेनिंगियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ड्यूरल लिम्फेटिक कलेक्टरों की ओर अवशोषित करती हैं जो खोपड़ी की हड्डियों को पार करती हैं और सीएनएस-ड्रेनिंग एलएनएस12, 14,14से जुड़ती हैं। ये मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाज सीएनएस रोगविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, क्योंकि मस्तिष्क मेनिंगियल लिम्फिटिक्स उम्र बढ़ने पर बदल जाते हैं और न्यूरोडिजेनरेशन, न्यूरोइंफ्लैमेशन, और मस्तिष्क कैंसर,15, 16,,17सहित न्यूरोलॉजिकल मस्तिष्क रोगों के परिणाम को भी प्रभावित करते हैं।16 इसलिए, सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक वाक्यूलेचर (यानी, सीएसएफ को निकालने वाले ड्यूरल और परिधीय लिम्फेटिक जहाज) मनुष्यों में सीएनएस रोगों का मुकाबला करने के लिए एक आशाजनक उपन्यास लक्ष्य हो सकता है।
इम्यूनोहिस्टोलॉजी और उच्च-संकल्प चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के साथ किए गए अभिसरण अध्ययनों से पता चला है कि मेनिंगियल लिम्फेटिक वैक्यूलेचर भी वानरों में मौजूद है, जिसमें आम मार्मोसेट बंदर और मनुष्य7,11,,13शामिल हैं।, इसके अलावा, मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाज खोपड़ी तक सीमित नहीं हैं, बल्कि कशेरुकी स्तंभ के भीतर रीढ़ की हड्डी गैंगलिया और रामी13, 18,18की सतह तक विस्तारित होते हैं। कशेरुकी स्तंभ लिम्फाटिक्स की त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग लेबल वाले कशेरुकी और रीढ़ के नमूनों की समग्र शरीर रचना विज्ञान को संरक्षित करती है, जिसमें ओवरलाइंग हड्डियों, मांसपेशियों, स्नायुबंधन, साथ ही पड़ोसी आंत के ऊतकों को शामिल किया गया था, हाल ही में14प्रदर्शन किया गया था। iDisco+ प्रोटोकॉल19,,20 का उपयोग झिल्ली रिसेप्टर LYVE1 21 या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर PROX122 के खिलाफ लिम्फेटिक-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पूरे कशेरुकी स्तंभ की पूरी कशेरुकी स्तंभ की तैयारी को इम्यूनोलेबेल करने के लिए कियागयाथा।21 छवि अधिग्रहण और विश्लेषण तो प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (LSFM) और Imaris सॉफ्टवेयर के साथ किया गया । एलएसएफएम रोशनी के अक्षीय कारावास द्वारा बड़े नमूनों की तेजी से और न्यूनतम आक्रामक 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कम फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सीसिटी23होती है।
iDISCO+/LSFM दृष्टिकोण ड्यूरल और एपीड्यूरल लिम्फेटिक जहाजों की अलग परतों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, और इस वाक्यूलेचर का संबंध एक्सवर्टिकल लिम्फेटिक सर्किट और एलएनएस कशेरुकी स्तंभ के पड़ोसी के लिए। प्रोटोकॉल पहले कशेरुकी नहर जल निकासी का प्रदर्शन करने के लिए फ्लोरोसेंट ट्रेसर के साथ इंजेक्शन ऊतकों के लिए लागू किया गया था । वर्तमान पत्र कशेरुकी लिम्फेटिक वैक्यूलेचर की छवि के लिए iDISCO+/LSFM पद्धति पर विवरण प्रदान करता है और सीएसएफ और एपीड्यूरल द्रव जल निकासी जांच के लिए अपनी प्रासंगिकता दिखाता है ।
iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल एक सेलुलर संकल्प स्तर पर अपने आसपास के ऊतकों के भीतर सीएनएस से जुड़े लसीका नेटवर्क के अभूतपूर्व 3 डी विचार प्रदान करता है । यह प्रोटोकॉल मध्यम आकार के नमूनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है, 1.5 सेमी3नहीं, एलएसएफएम ऑप्टिकल सिस्टम की सीमाओं, कम काम की दूरी और उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी23के लिए वाणिज्यिक उद्देश्य लेंस के बड़े आकार के कारण। यह सीमा पूरे मस्तिष्क से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली को कैप्चर करने से रोकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जांच के क्षेत्र को सावधानी से सीमित किया जाना चाहिए और सीएनएस के आसपास के ऊतकों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया जाना चाहिए ताकि एक्सट्राक्रैनियल लिम्फेटिक जहाजों और एलएन को शामिल किया जा सके जो पूरे लिम्फेटिक सर्किटरी(तालिका 2)में योगदान देते हैं।
आकार और शारीरिक विचारों के अलावा, आसपास के मेसेंचिमल ऊतकों की जटिलता खोपड़ी और कशेरुकी स्तंभ के साथ भिन्न होती है, जिसके लिए एक सजातीय नमूना स्पष्टीकरण प्राप्त करने और नरम आइसोट्रोपिक जैविक ऊतक के भीतर प्रकाश बीम प्रचार की अनुमति देने के लिए डिक्लेबिलिटी और प्रीक्लीयरिंग उपचार के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हड्डियों के अभाव में, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के एलएफएसएम इमेजिंग को डिकलिफिकेशन चरण की आवश्यकता नहीं होती है, और कैप्चर की गई छवियों का अंतिम संकल्प इष्टतम19है। उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल, जिसमें मोर्स के समाधान के साथ एक हल्का डिक्लेक्टिफिकेशन कदम शामिल है, को चित्र 1 और चित्रा 4में सचित्र कशेरुका स्तंभ के एलएसएफएम इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है। इसके विपरीत, गर्दन क्षेत्र मांसपेशियों, वसा और ग्रंथि ऊतकों की कई परतों के अलावा एक विशेष रूप से जटिल हड्डी शरीर रचना विज्ञान प्रदर्शित करता है, जो चित्र 3बीमें परिलक्षित होने वाले एलएसएफएम छवियों की गुणवत्ता को कम करता है। इस प्रकार ऊतकों के अधिक कठोर उपचार से गर्दन और गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र की एलएसएफएम इमेजिंग में सुधार हो सकता है; उदाहरण के लिए, EDTA के साथ, जैसा कि पहले24रिपोर्ट किया गया था । इसलिए डिक्लेक्टिफिकेशन स्टेप महत्वपूर्ण है और डिक्लेक्टिफिकेशन कंडीशन को पहले पूर्ण iDISCO+ प्रोटोकॉल(टेबल 2)शुरू करने से पहले इस्तेमाल किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।
जबकि iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल मेनिंगियल और एपीड्यूरल रिक्त स्थान और संबद्ध एलएन के बीच सर्किट को जोड़ने के 3 डी दृश्य की उत्पादन की अनुमति देता है, LSFM-कैप्चर की गई छवियों से लिम्फेटिक वैक्यूलेचर का प्रत्यक्ष मात्रात्मक विश्लेषण निम्नलिखित कारणों से संभव नहीं है: 1) लिम्फेटिक मार्कर अभिव्यक्ति के असतत पैटर्न के कारण लिम्फेटिक पोत सर्किट का चित्रण अविश्वसनीय है, क्योंकि मेम्ब्रानार LYVE1 को21 वितरित किया गया है और प्रोक्स 1 में परमाणु अभिव्यक्ति पैटर्न22है; 2) एंटीबॉडी के विषम प्रवेश, साथ ही साथ एनिसोट्रोपी जो अपूर्ण और विषम डिसलिफिकेशन और प्रीक्लीयरिंग के कारण जैविक ऊतकों में बनी रह सकती है। एलएसएफएम इमेजिंग को इस प्रकार आभासी वास्तविकता उपकरणों द्वारा विस्तारित करने की आवश्यकता है जो इंटरैक्टिव दृश्य को सक्षम करते हैं और इस प्रकार लिम्फेटिक वैक्यूलेचर (www.syglass.io) के मात्राकरण की सुविधा प्रदान करते हैं। यह भी उल्लेखनीय है कि सीएनएस से जुड़े सर्किटरी के सटीक विवरण के लिए एलएसएफएम जानकारी को उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल डेटा के साथ समर्थन देने की आवश्यकता होती है, जो पारंपरिक इम्यूनोलाबेलिंग द्वारा प्राप्त की गई पतली (5-10 माइक्रोन) क्रायोस्टेट या पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों पर है, विशेष रूप से ड्यूरा मेटर और सीएसएफ के संबंध में लिम्फेटिक जहाजों की स्थिति को ठीक से स्थानीयकृत करने के लिए, जैसा कि पहले11,14,,18बताया गया था।,
आईआईडस्को+/LSFM प्रोटोकॉल सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक सिस्टम में मैक्रोमॉलिक्यूलर ड्रेनेज के त्रि-आयामी दृश्य की अनुमति देता है, जैसा कि चित्र 3 और चित्रा 4 में दर्शाया गया है । Figure 4 हालांकि, लिम्फेटिक ड्रेनेज के कार्यात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, उपरोक्त विस्तृत iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल पर सिफारिशों के अलावा, एक कठोर प्रक्रिया का पालन करते हुए, क्योंकि अंतिम परिणाम इंजेक्शन सर्जरी की गुणवत्ता, वितरण स्थल की पसंद, मैक्रोमॉलिकेल मार्कर के प्रकार और इंजेक्शन मात्रा पर निर्भर करता है, और ट्रेसर प्रशासन(टेबल 2)के बाद बलिदान कासमय। इंजेक्शन जानवरों के बीच ट्रेसर पैटर्न की विविधताओं के कारण, लिम्फेटिक ड्रेनेज सर्किट के लक्षण वर्णन के लिए बड़े प्रायोगिक समूहों (इंजेक्शन की स्थिति से & 10) की आवश्यकता होती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, 1) ड्यूरा मेटर को इंजेक्शन से पहले पंचर किया जाना चाहिए ताकि अवांछित घावों और सीएनएस ऊतकों में प्रवेश को रोका जा सके; 2) इंजेक्शन की मात्रा को इंजेक्शन छेद के माध्यम से अवांछित प्रसार को सीमित करने के लिए इंजेक्शन केशिका के साथ, एपीड्यूरल स्पेस या एक्सवर्टेब्रल ऊतकों में इंजेक्शन की मात्रा 2 माइक्रोन से कम होनी चाहिए; 3) इंजेक्शन केशिका प्रविष्टि की गहराई को क्रमशः आईसीएम और इंट्रास्पिनल इंजेक्शन में सीएनएस चोट या मिस्टैर्गेटिंग से बचने के लिए ड्यूरा मेटर के नीचे 2 मिमी तक सीमित होना चाहिए। यह भी ध्यान दें कि पड़ोसी कशेरुकी खंडों के एक पूरक उच्च संकल्प कॉन्फोकल विश्लेषण किया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर संकेत दिया गया है, लिम्फेटिक जहाजों के अंदर इंजेक्शन ट्रेसर की उपस्थिति का आकलन करने के लिए। इस विश्लेषण में ट्रेसर के लिए तीव्रता प्रोफाइल भूखंडों और मार्कर-लेबल वाले लिम्फेटिक जहाजों के क्रॉस सेक्शन पर लिम्फेटिक मार्कर की स्थापना की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण को पहले इंजेक्शन के बाद 15 मिनट में ThLb लिम्फाटिक्स द्वारा OVA555 तेज प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (याकूब एट अल में पूरक चित्रा5F)। हालांकि, यह वर्तमान अध्ययन(चित्रा 4)में एंटी-LYVE1 ट्रेसर के लिए सचित्र नहीं किया गया है ।
संभावित सीएसएफ ट्रेसर्स में, ओवीए-ए555 एक उत्कृष्ट विकल्प है क्योंकि यह आईआईडस्को+ प्रोटोकॉल उपचार के लिए प्रतिरोधी है और एलएसएफएम इमेजिंग के लिए उच्च फ्लोरेसेंस रखता है। हालांकि, ध्यान दें कि ट्रेसर के प्रकार को विश्लेषण समय बिंदु(तालिका 1 और तालिका 2)के अनुसार चुना जानाचाहिए। जैसा कि ऊपर बताया गया है, स्थानीय कशेरुकी लिम्फेटिक जहाजों की ओवा-ए555 लेबलिंग इंजेक्शन14के बाद 15 मिनट पर देखी जाती है। हालांकि, OVA-A555 अब एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी (चित्रा 4) के विपरीत इंजेक्शन(चित्रा 3)के बादFigure 445 मिनट पर इन स्थानीय लसीका सर्किट में पता नहीं चला है।
समाप्त करने के लिए, iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल अच्छी तरह से 3 डी संरचना और सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक प्रणाली के जल निकासी की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है जैसे सीएनएस और कशेरुकी कॉलम कैंसर, या कशेरुकी हड्डी और संयुक्त रोगों के रूप में शारीरिक और रोग की स्थिति में । हालांकि पूरी प्रक्रिया लंबी है और पद्धतिगत कठोरता की आवश्यकता है, यह मूल्यवान, अद्वितीय जानकारी प्रदान करता है जब आभासी वास्तविकता उपकरण और उच्च संकल्प कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग कर पूरक विश्लेषण के साथ इस्तेमाल किया ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को इंस्टीटयूट नेशनल डी ला सेंटे एट डी ला रेचेचे मेडिकल द्वारा समर्थित किया गया था, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), फेडरेशन डालना ला Recherche सुर le Cerveau (FRC २०१७), Carnot Maturation (एल जे के लिए), Universidade फेडरल डी रियो डी Janiero (जेबी के लिए UFRJ), NIH (R01EB016629-01) और येल स्कूल हम आईसीएम प्लेटफार्मों को स्वीकार करते हैं: सेलुलर इमेजिंग के लिए आईसीएम-क्वांट और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए आईसीएम-हिस्टोमिक्स। सभी पशु कार्य फेनो-आईसीमाइक सुविधा में आयोजित किए गए थे। कोर को 2 “इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनिर” (एएनआर-10- आईएआईएचयू-06 और एएनआर-11-आईएनबीएस-0011-न्यूरेट्रिस) और “प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल” द्वारा समर्थित है। हम विधि पद्धति सलाह और पांडुलिपि पढ़ने के लिए निकोलस रेनियर स्वीकार करते हैं ।
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |