التصوير الحي للخلايا من دورة حياة البكتيريا المفترس Bdellovibrio bacteriovorus باستخدام المجهر الفلوري الوقت الفاصل
Summary
هنا هو بروتوكول يصف رصد دورة الحياة الكاملة للبكتيريا المفترسة Bdellovibrio bacteriovorus باستخدام المجهر الفلوري الفاصل الزمني في تركيبة مع وسادة agarose وأطباق التصوير الخلوي.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة سالبة الغرام ، ملزمة المفترسة التي تقتل البكتيريا الأخرى سلبية الغرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة. ولذلك، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي. لتطبيق B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، من الضروري أولاً فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها المعقدة ، ولا سيما انتشارها داخل الفريسة. وحتى الآن، كان من الصعب رصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة في الوقت الحقيقي. هنا هو بروتوكول شامل للتصوير في الوقت الحقيقي من دورة حياة كاملة من bacteriovorus B.، وخصوصا خلال نموها داخل المضيف. لهذا الغرض، يتم استخدام نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع أطباق التصوير الخلوي، والتي يمكن للخلايا المفترسة التحرك بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة مشلّمة قادرة على تشكيل bdelloplasts. تطبيق سلالة إنتاج الفلورسنت الموسومة β-الوحدة الفرعية من الحمض النووي بوليميراز الثالث يسمح كذلك تكرار كروموسوم ليتم رصدها خلال مرحلة التكاثر من دورة حياة B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة (0.3-0.5 ميكرومتر من 0.5-1.4 ميكرومتر) بكتيريا سلبية الغرام التي تفترس البكتيريا الأخرى السالبة للجرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة مثل Klebsiella pneumoniae ، Pseudomonas aeruginosa ، وSingella flexneri1،2،3. وبما أن ب. البكتيريا تقتل مسببات الأمراض، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي محتمل يمكن تطبيقه لمكافحة العدوى البكتيرية، وخاصة تلك الناجمة عن سلالات مقاومة للأدوية المتعددة.
B. bacteriovorus يعرض دورة حياة غريبة تتكون من مرحلتين: مرحلة الهجوم غير تكراري العيش الحر ومرحلة الإنجاب داخل الخلايا(الشكل 1). في مرحلة العيش الحر ، تبحث هذه البكتيريا المتحركة العالية ، التي تتحرك بسرعة تصل إلى 160 ميكرومترًا في الثانية ، عن فريستها. بعد ربطها بالغشاء الخارجي للفريسة ، تدخل periplasm4،5. خلال مرحلة الإنجاب بين الحولية، يستخدم B. bacteriovorus مجموعة كبيرة من الإنزيمات الهيدرولوجية لإنزيمات الجزيئات الكبيرة للمضيف وإعادة استخدامها لنموها الخاص. بعد وقت قصير من غزو periplasm ، تموت الخلية المضيفة وتنتفخ في بنية كروية تسمى bdelloplast ، داخلها تتكاثر الخلية المفترسة وتستنسخ كروموسوماتها. تبدأ عملية النسخ المتماثل في أصل النسخ المتماثل (oriC)6 و تستمر حتى يتم تصنيع عدة نسخ من الكروموسوم بشكل كامل7. ومن المثير للاهتمام، لا يتبع تكرار كل كروموسوم من قبل انقسام الخلايا. بدلا من ذلك، يطول المفترس لتشكيل خلية طويلة ومتعددة النوى والخيوط. عند استنفاد المغذيات ، يخضع الخيط لزنزانة متزامنة ويتم تحرير الخلايا النسلية من bdelloplast8.
قبل أن يمكن استخدام البكتيريا البكتيرية كمضادات حيوية حية ضد العدوى البكتيرية ، من المهم فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها ، لا سيما تلك المتعلقة بانتشارها داخل الفريسة. وقد تم تصوير الخلايا الحية من B. bacteriovorus تحديا، وذلك بسبب الأشكال المورفولوجية المختلفة للمفترس وفريسته خلال دورة الحياة المعقدة. حتى الآن، تمت دراسة التفاعلات بين B. bacteriovorus وخليتها المضيفة بشكل رئيسي عن طريق المجهر الإلكتروني وتحليل snap-shot2،9،10، وكلاهما له قيود ، خاصة عندما يتم استخدامها لرصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة. توفر هذه الطرق صورًا عالية الدقة لخلايا البكتيريا B. وتمكن من مراقبة مفترس صغير أثناء مرحلة الهجوم أو النمو. ومع ذلك، فإنها لا تسمح لتتبع واحد B. bacteriovorus الخلايا خلال كل من مراحل دورة الحياة.
هنا هو بروتوكول شامل لاستخدام الوقت الفاصل المجهر fluorescence (TLFM) لرصد دورة الحياة الكاملة من B. bacteriovorus. ويستخدم نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع طبق التصوير الخلوي، والتي يمكن أن تتحرك الخلايا المفترسة بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة شلت قادرة على تشكيل bdelloplasts (الشكل 2). يتم إعداد هذا الإعداد على أساس سلالات محددة من كل من الإشريكية القولونية وB. bacteriovorus، ولكن يمكن تغيير البروتوكول بسهولة لتناسب سلالات المستخدم الفردية (على سبيل المثال ، تحمل علامات اختيار مختلفة ، والبروتينات التي تنصهر مع الفلوروفورس المختلفة ، وما إلى ذلك).
في هذه الحالة، لتصور B. bacteriovorus خلال مرحلة الهجوم، سلالة محددة (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) التي تعبر عن نسخة الفلورسنت الموسومة من البروتين السيتوبلازمي، بيلز (المتاحة في مختبرنا عند الطلب)7. وتنتج هذه السلالة بالإضافة إلى ذلك DnaN (المشبك β الانزلاق)، وهي وحدة فرعية من الحمض النووي البوليمر الثالث هولوينزيم، تنصهر مع بروتين الفلورسنت. وهذا يتيح إمكانية رصد تكرار الحمض النووي المستمر داخل الخلايا المفترسة أثناء نموها داخل البلاستات.
على الرغم من أن البروتوكول والبرامج المذكورة المستخدمة للحصول على الصور تشير إلى مجهر مقلوب المقدمة من قبل شركة تصنيع محددة (انظر جدول المواد)، يمكن تعديل هذه التقنية لأي مجهر مقلوب مجهز بغرفة بيئية أو حامل تدفئة خارجي آخر وقادر على التصوير الفاصل الزمني. لتحليل البيانات، يمكن للمستخدمين اختيار أي برنامج متاح متوافق مع تنسيقات الإخراج الفردية.
الشكل 1: دورة حياة ب. bacteriovorus في الإشريكية القولونية كخلية مضيفة. خلال مرحلة الهجوم، خلية سباحة حرة B. bacteriovorus تبحث عن وتعلق على خلية الإشريكية القولونية المضيف. بعد الغزو، تصبح الخلية المفترسة موضعية في periplasm الفريسة، وتغيير شكل الخلية المضيفة وتشكيل bdelloplast. تبدأ المرحلة الإنجابية بتكوين البلاست. الخلية المفترسة يهضم الخلية الفريسة ويعيد استخدام المركبات البسيطة لبناء هياكلها الخاصة. B. bacteriovorus ينمو كما خيوط واحدة طويلة داخل periplasm المضيف. عندما تستنفد موارد الخلية الفريسة ، فإن خيوط B. bacteriovorus تتزامن وتشكل الخلايا النسل. بعد الخلايا ذرية تطوير flagella بهم، أنها lyse bdelloplast. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب زيادة الاهتمام باستخدام B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لمراقبة دورة الحياة المفترسة ، ولا سيما التفاعلات بين الحيوانات المفترسة والمسببات. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتتبع دورة حياة B. bacteriovorus بأكملها ، خاصة أثناء نموها داخل المضيف ، في الوقت الفعلي. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل المركز الوطني للعلوم منحة أوبوس 2018/29/B/NZ6/00539 إلى J.Z.C.
Materials
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555———-K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
