I Utero Electroporation af Multiaddressable Genome-Integration Color (MAGIC) Markører til individualisere Cortical Mouse Astrocytes
Summary
Astrocytter flise hjernebarken ensartet, hvilket gør analysen af deres komplekse morfologi udfordrende på cellulært niveau. Protokollen her bruger flerfarvet mærkning baseret på in utero elektroporation til at fremhæve kortikale astrocytter og analysere deres volumen og morfologi med en brugervenlig billedanalysepipeline.
Abstract
Protoplasmiske astrocytter (PrA) placeret i musens hjernebark er tæt sammenstillet og danner en tilsyneladende kontinuerlig tredimensionel matrix på voksne stadier. Hidtil har ingen immunostaining strategi kan udpege dem ud og segmentere deres morfologi i modne dyr og i løbet af kortikogenese. Cortical PrA stammer fra forfædre placeret i dorsal pallium og kan nemt målrettes ved hjælp af i livmoderen elektroporation af integrative vektorer. En protokol præsenteres her for at mærke disse celler med den multiaddressable genom-integrerende farve (MAGIC) Markører strategi, som er afhængig af piggyBac / Tol2 gennemførelse og Cre /lox rekombination til stokastisk udtrykke forskellige fluorescerende proteiner (blå, cyan, gul og rød) rettet til specifikke subcellulære rum. Denne flerfarvede skæbne kortlægning strategi gør det muligt at markere in situ nærliggende kortikale forfædre med kombinationer af farve markører forud for starten af gliogenesis og til at spore deres efterkommere, herunder astrocytter, fra embryonale til voksne stadier på det enkelte celleniveau. Semi-sparsom mærkning opnås ved at justere koncentrationen af elektroporated vektorer og farve kontraster fra Multiaddressable Genome-Integration Color Markører (MAGIC Markører eller MM) gør det muligt at individualisere astrocytter og fremhæve deres område og komplekse morfologi på trods af deres tætte anatomiske arrangement. Præsenteret her er en omfattende eksperimentel arbejdsgang, herunder detaljerne i elektroporation procedure, multikanal billede stakke erhvervelse af konfokal mikroskopi, og computer-assisteret tre-dimensionelle segmentering, der vil gøre det muligt for eksperimentator at vurdere de enkelte PrA volumen og morfologi. Sammenfattende giver elektroporation af MAGIC Markers en bekvem metode til individuelt at mærke adskillige astrocytter og få adgang til deres anatomiske træk på forskellige udviklingsstadier. Denne teknik vil være nyttig til at analysere kortikale astrocyt morfologiske egenskaber i forskellige musemodeller uden at ty til komplekse kryds med transgene reporterlinjer.
Introduction
Astrocytter spiller mange vitale funktioner i hjernens udvikling og fysiologi1. Ved siden af deres rolle ved blod-hjerne barrieren, hvor de regulerer optagelse af næringsstoffer og blodgennemstrømning, bidrager de aktivt til synapsedannelse og funktion, mens de producerer neuromodulatorer, der kan ændre neuronal aktivitet og adfærd2. Desuden bidrager astrocyt dysfunktion til en række neurologiske lidelser3. Astrocytter placeret i hjernebarken viser en udførlig morfologi, der muliggør omfattende kontakt med neuronale processer. Disse kontakter, der er afgørende for kredsløbsfunktionen, styrer også astrocytmorfogenese og synaptogenese gennem celle vedhæftningsproteiner4. Neuroforskere har brug for praktiske og robuste værktøjer til at undersøge astrocyt udvikling og morfogenese i deres neurologiske modeller af interesse. Men på grund af den tætte apposition af astrocytter til deres naboer og deres ensartede tredimensionelle fliser, er det udfordrende at fremhæve kortikale astrocytter og omfattende vurdere deres morfologi ved hjælp af immunomarkører.
I øjeblikket gør to af de vigtigste genteknologiske strategier det muligt at mærke og individualisere kortikale astrocytter in situ: sparsom reporteraktivering i transgene muselinjer eller somatisk transgenese ved hjælp af elektroporation af reporter plasmider. Den første strategi bygger på opdræt af en floxed reporter mus linje med mus udtrykke en inducible form for Cre recombinase aktiveret specifikt i astrocytter på tamoxifen levering (f.eks Aldh1l1-CreERT25). Der er flere ulemper forbundet med denne strategi. For det første kræver avlstransgene mus et stort antal dyr, og der er typisk behov for flere analyseforanstaltninger for at bestemme den korrekte dosis tamoxifen for at give tilstrækkeligt sparsom mærkning af kortikale astrocytter. Analyse kortikale astrocyt fænotyper i en genetisk mus model af interesse vil kræve endnu mere avl og mus forbrug. Desuden, in utero tamoxifen injektion er kendt for at forstyrre parturition, hvilket gør denne strategi vanskeligt at anvende til studiet af de tidligste stadier af astrocyt udvikling. In vivo DNA-elektroporation er en alternativ tamoxifenfri strategi, der er afhængig af et minimum antal dyr6. Udføres enten på embryonale eller postnatal stadier, denne tilgang består i at injicere reporter plasmider i laterale hjertekamrene af gnavere efterfulgt af elektriske impulser, der skaber porer i cellemembranen, og dermed tillade DNA at komme ind stamceller foring hjertekammeret. Derefter behandles de reportertransgener, der bæres af de elektroporated plasmider, af de målrettede cellemaskiner og udtrykkes7. To elektroporationsmetoder er tidligere blevet beskrevet for at mærke mus kortikale astrocytter: 1) Postnatal astrocytmærkning ved elektroporation (PALE), som er afhængig af elektroporation af 1-2 enfarvet episomal reporter plasmider i tidlige postnatale stadier4; 2) StarTrack-strategien baseret på in utero electroporation (IUE) af flere ensfarvede integrative reporter plasmids8,9,10. Selvom disse to teknikker effektivt mærker PrA i hjernebarken, udgør de også nogle begrænsninger. I deres oprindelige version er begge metoder afhængige af en glial fibrillary sur protein (GFAP) promotor til at drive udtryk i astrocytter, som kan bias mærkningen mod radial glia samt pial og reaktive astrocytter, der udtrykker GFAP stærkere end normalt hvile PrA11,12. Med hensyn til PALE er andre ulemper det sene stadium af elektroporation, som forhindrer mærkning af tidlig født PrA (eller dem, der stammer fra tidlige delaminerende forfædre) og analyse af tidlige stadier af astrogliaudvikling og brugen af episomale vektorer, der bliver fortyndet gennem successive divisioner under den massive spredning, som PrA gennemgår i løbet af den første postnatal uge13,14. I modsætning til PALE er StarTrack baseret på den embryonale elektroporation af integrative reporterplasmider, der gør det muligt at spore bidraget fra både embryonale og postnatale forfædre til PrA. En opdateret StarTrack ordning bygger på ubiquitin C promotor (UbC-StarTrack)opnår bredere udtryk for fluorescerende reportere i både neuronale og glial afstamning (astrocytter inkluderet) af neurale forfædre15,16,17. I sin nuværende version er gennemførelsen af denne tilgang imidlertid kompleks, da den bygger på en ligeværdig blanding af 12 forskellige plasmider, der udtrykker seks fluorescerende proteiner (FP) med delvis excitation og emissionsspektreoverlapning.
Præsenteret her er en ligetil i livmoderen elektroporation-baserede multicolor mærkning metode ved hjælp af integrative reporter konstruktioner drevet af en stærk og bredt aktiv initiativtager til at fremhæve kortikale astrocytter14. Derudover leveres en nem billedanalysepipeline ved hjælp af både licenseret (f.eks. Imaris) og åben adgang (Vaa3D18,19,20) billedanalysesoftware til segmentering af henholdsvis astrocyt territorial volumen og arborization. Sammenlignet med de tidligere beskrevne metoder er denne strategi udelukkende baseret på 1-2 multicolor integrative transgener Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers eller MM21) rettet mod det cytoplasmiske og (eventuelt) nukleare cellerum, hvis udtryk er drevet af en syntetisk CAG-promotor bestående af en cytomegalovirusforstærker, kylling β-actin promotor, og kanin β-globin splejse acceptor site22. Dette gør det muligt at mærke og spore kortikale astrocytter, fra embryonale til sene postnatale stadier, uafhængigt af GFAP-udtryk14,23. Hver af disse transgener har følgende fire forskellige FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP og tdTomato/mCherry, som udviser minimal spektral overlapning, der let kan omgås med 1) Sekventiel kanalerhvervelse; 2) Optimeret excitation magt og indsamling gevinst; og 3) Specifikke dichroic filtre til at indsamle smalle FP emission vinduer. MM-strategien bruger Cre /lox rekombination med en selv-excisable Cre recombinase (seCre) til at køre stokastisk udtryk for FP i en cellulær befolkning. En enkelt kopi af MM transgene udtrykker FP på en gensidigt udelukkende måde, mens flere transgener giver anledning til FP kombinationer, hvilket skaber snesevis af forskellige nuancer. Genomisk integration af transgenes er drevet af piggyBac (PB) eller Tol2 gennemførelsessystem24,25,26. Derfor muliggør MM-værktøjskassen og den flerfarvede ‘mosaik’, som den genererer, samtidig mærkning af flere tilstødende kortikale forfædre og sporing af deres glia nedstigning, herunder kortikale astrocytter, over lange perioder. Farvekontrast som følge af udtrykket af forskellige FP tillade afgrænsning af konturen af PrA og efterfølgende udtrække vigtige oplysninger om deres territoriale volumen (ved hjælp af IMARIS) og komplekse morfologi (ved hjælp af Vaa3D). Den flerfarvede strategi, der præsenteres i detaljer her, er en praktisk og robust metode, der giver hurtig og nem adgang til den kortikale astrocytoverflade og morfologi i vilde typemus på forskellige udviklingsstadier og er let at tilpasse til at undersøge astrocytiske anatomiske træk i musemodeller af neurologiske sygdomme uden brug af transgene reporterlinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I livmoderelektroporation (IUE) af MAGIC-markører i kortikale forfædre (figur 1) aktiverede mærkning af astrocytter i hele den postnatale hjernebark på forskellige postnatale stadier (P4-P7-P21, Figur 2). Interessant nok er fasen af IUE ikke kritisk, da elektroporation udført fra E13.5 til E15.5 giver lignende mærkningsmønstre vedrørende kortikale astrocytter14. Placeringen af mærkede pyramide neuroner i kortikale parenchyma vari…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker S. Fouquet og billeddannelse og dyrekernefaciliteter på Institut de la Vision og Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI og RAM) for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af stipendier fra Région Ile-de-France og Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer til S.C og fra Université Paris-Saclay (Initiativer Doctorales Interdisciplinaires) til LA ved hjælp af støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC-SG 336331, PI J. Valette) til E.H., af Agence Nationale de la Recherche i henhold til kontrakter ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Frankrig BioImaging) , af Fondation pour la Recherche Médicale (ref. DBI20141231328), af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) og af ATIP-Avenir program (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
