कॉर्टिकल माउस एस्ट्रोसाइट्स को व्यक्तिगत बनाने के लिए बहु-इंट्रेस्ड जीनोम-इंटीग्रेटिंग कलर (मैजिक) मार्कर के यूटेरो इलेक्ट्रोपंट्रेशन में
Summary
एस्ट्रोसाइट्स ने सेरेब्रल कॉर्टेक्स को समान रूप से टाइल किया, जिससे सेलुलर स्तर पर उनकी जटिल आकृति विज्ञान का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो जाता है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में यूटेरो इलेक्ट्रोपॉनेशन के आधार पर मल्टीकलर लेबलिंग का उपयोग किया जाता है ताकि कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को बाहर किया जा सके और उपयोगकर्ता के अनुकूल छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ उनकी मात्रा और आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया जा सके।
Abstract
माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स में स्थित प्रोटोप्लाज्मिक एस्ट्रोसाइट्स (पीआरए) कसकर निकटता वाले होते हैं, जो वयस्क चरणों में जाहिरा तौर पर निरंतर त्रि-आयामी मैट्रिक्स बनाते हैं। इस प्रकार अब तक, कोई इम्यूनोस्टेटिंग रणनीति उन्हें बाहर नहीं कर सकती है और परिपक्व जानवरों में और कॉर्टिकोजेनेसिस के दौरान उनकी आकृति विज्ञान को खंडित कर सकती है। कॉर्टिकल पीआरए पृष्ठीय पैलियम में स्थित जनकों से उत्पन्न होता है और आसानी से एकीकृत वैक्टर के यूटेरो इलेक्ट्रोपाउरेशन में उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है। एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाता है बहुदंचालित जीनोम एकीकृत रंग (जादू) मार्कर रणनीति है, जो piggyBac/Tol2 पक्षांतरण औरCre/lox पुनर्संयोजन पर निर्भर करता है के साथ इन कोशिकाओं लेबल के लिए stochastically व्यक्त अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (नीला, सियान, पीला, और लाल) विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बों को संबोधित किया । यह बहुरंगी भाग्य मानचित्रण रणनीति ग्लोजेनेसिस की शुरुआत से पहले रंग मार्कर के संयोजन के साथ सीटू पास के कॉर्टिकल प्रोजेनिटर में चिह्नित करने और व्यक्तिगत कोशिका स्तर पर भ्रूण से वयस्क चरणों तक एस्ट्रोसाइट्स सहित उनके वंशजों को ट्रैक करने में सक्षम बनाती है। बहुद्रेसेबल जीनोम-एकीकृत रंग मार्कर (मैजिक मार्कर या एमएम) द्वारा प्रदान किए गए इलेक्ट्रोपोटेड वैक्टर और रंग विरोधाभासों की एकाग्रता को समायोजित करके प्राप्त अर्ध-विरल लेबलिंग एस्ट्रोसाइट्स को व्यक्तिगत बनाने और अपने घने शारीरिक व्यवस्था के बावजूद अपने क्षेत्र और जटिल आकृति विज्ञान को अलग करने में सक्षम बनाता है। यहां प्रस्तुत एक व्यापक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह है जिसमें इलेक्ट्रोपॉशन प्रक्रिया का विवरण, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मल्टीचैनल इमेज स्टैक अधिग्रहण और कंप्यूटर-असिस्टेड त्रि-आयामी विभाजन शामिल है जो प्रयोगकर्ता को व्यक्तिगत पीआरए वॉल्यूम और आकृति विज्ञान का आकलन करने में सक्षम बनाएगा। संक्षेप में, मैजिक मार्कर का इलेक्ट्रोपॉशन व्यक्तिगत रूप से कई एस्ट्रोसाइट्स को लेबल करने और विभिन्न विकासात्मक चरणों में उनकी शारीरिक विशेषताओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के साथ जटिल क्रॉस का सहारा लिए बिना विभिन्न माउस मॉडलों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट रूपात्मक गुणों का विश्लेषण करने के लिए यह तकनीक उपयोगी होगी।
Introduction
खगोल विज्ञान मस्तिष्क के विकास और शरीर विज्ञान में कई महत्वपूर्ण कार्य करते हैं1. रक्त-मस्तिष्क बाधा में उनकी भूमिका के अलावा जहां वे पोषक तत्वों के तेज और रक्त प्रवाह को विनियमित करते हैं, वे न्यूरोमोडुलेटर का उत्पादन करते समय इसके गठन और कार्य में सक्रिय रूप से योगदान देते हैं जो न्यूरोनल गतिविधि और व्यवहार2को बदल सकते हैं। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट डिसफंक्शन विभिन्न प्रकार के न्यूरोलॉजिकल विकारों में योगदान देता है3। सेरेब्रल कॉर्टेक्स में स्थित एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोनल प्रक्रियाओं के साथ व्यापक संपर्क को सक्षम करने वाली एक विस्तृत आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है। ये संपर्क, सर्किट फ़ंक्शन के लिए आवश्यक, सेल-आसंजन प्रोटीन4के माध्यम से एस्ट्रोसाइट मॉर्फोजेनेसिस और सिंप्टोजेनेसिस को भी नियंत्रित करते हैं। न्यूरोसाइंटिस्टों को अपने ब्याज के न्यूरोलॉजिकल मॉडल में एस्ट्रोसाइट विकास और मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने के लिए सुविधाजनक और मजबूत उपकरणों की आवश्यकता होती है। हालांकि, अपने पड़ोसियों और उनके समान त्रि-आयामी टाइलिंग के लिए एस्ट्रोसाइट्स के करीबी अपोजिशन के कारण, कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को बाहर करना और इम्यूनोमार्कर का उपयोग करके उनके आकृति विज्ञान का व्यापक आकलन करना चुनौतीपूर्ण है।
वर्तमान में, दो मुख्य जेनेटिक इंजीनियरिंग रणनीतियां सीटू में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लेबलिंग और वैकरण को सक्षम करती हैं: रिपोर्टर प्लाज्मिड के इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक माउस लाइनों या दैहिक ट्रांसजेनेसिस में विरल रिपोर्टर सक्रियण। पहली रणनीति चूहों के साथ एक फड़फड़ा रिपोर्टर माउस लाइन के प्रजनन पर निर्भर करती है जो विशेष रूप से टैमोक्सिफेन डिलीवरी (जैसे, Aldh1l1-CreERT25)पर एस्ट्रोसाइट्स में सक्रिय क्रे रिकॉम्बिनेंट के एक निष्क्रिय रूप को व्यक्त करती है। इस रणनीति से कई नुकसान जुड़े हैं। सबसे पहले, प्रजनन ट्रांसजेनिक चूहों को बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है और कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की पर्याप्त रूप से विरल लेबलिंग प्रदान करने के लिए टैमोक्सिफेन की उचित खुराक निर्धारित करने के लिए कई परख की आवश्यकता होती है। ब्याज के आनुवंशिक माउस मॉडल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए और भी अधिक प्रजनन और माउस की खपत की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, गर्भाशय टैमोक्सिफेन इंजेक्शन में पार्टिसिपरिट्यूशन में हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है, जिससे इस रणनीति को एस्ट्रोसाइट विकास के शुरुआती चरणों के अध्ययन पर लागू करना मुश्किल हो जाता है। वीवो डीएनए इलेक्ट्रोपॉन्टेशन में एक वैकल्पिक टैमोक्सिफेन-मुक्त रणनीति है जो कम से कम जानवरों की संख्या पर निर्भर करती है6। भ्रूणीय या प्रसवोत्तर चरणों में या तो किया जाता है, इस दृष्टिकोण में कृंतकों के पार्श्व वेंट्रिकल्स में रिपोर्टर प्लाज्मिड इंजेक्शन होते हैं जिसके बाद विद्युत दालें होती हैं जो कोशिका झिल्ली में छिद्र बनाती हैं, इसलिए डीएनए को वेंट्रिकल अस्तर की प्रोजेनिटर कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है। इसके बाद, इलेक्ट्रोपेटेड प्लाज्मिड द्वारा किए गए रिपोर्टर ट्रांसजीन को लक्षित सेल मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है और 7 व्यक्त कियाजाताहै। दो इलेक्ट्रोपॉरेशन विधियों को पहले माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स लेबल करने के लिए वर्णित किया गया है: 1) इलेक्ट्रोपॉशन (पेले) द्वारा पोस्टनेट एस्ट्रोसाइट लेबलिंग, जो शुरुआती प्रसवोत्तर चरणों में 1-2 एकल रंग एपिसोमल रिपोर्टर प्लाज्मिड्स के इलेक्ट्रोपॉर्मेशन पर निर्भर करता है4; 2) कई एकल रंग एकीकृत रिपोर्टर प्लाज्मिड्स8,9,10के यूटेरो इलेक्ट्रोप्यूरेशन (आईयूई) में आधारित स्टारट्रैक रणनीति । हालांकि इन दो तकनीकों कुशलता से मस्तिष्क प्रांतस्था में पीआरए लेबल, वे भी कुछ सीमाएं मौजूद हैं । अपने प्रारंभिक संस्करण में, दोनों विधियां एस्ट्रोसाइट्स में अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर पर भरोसा करते हैं, जो रेडियल ग्लिया के साथ-साथ पिल और प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स की ओर लेबलिंग को पूर्वाग्रह कर सकता है जो सामान्य आराम पीआरए11, 12की तुलना में GFAP को अधिक दृढ़ता से व्यक्त करता है। पीला के बारे में, अन्य नुकसान इलेक्ट्रोपाउशन के देर से चरण हैं, जो प्रारंभिक जन्म वाले पीआरए (या शुरुआती डेलामिनेटिंग प्रोजेनिटर्स से उत्पन्न होने वाले) और एस्ट्रोग्लिया विकास के शुरुआती चरणों के विश्लेषण और एपिसोमल वैक्टर का उपयोग रोकता है जो पहले प्रसवोत्तर सप्ताह13,14के दौरान लगातार विभाजन के माध्यम से पतला हो जाते हैं। पीला के विपरीत, स्टारट्रैक एकीकृत रिपोर्टर प्लाज्मिड्स के भ्रूणीय इलेक्ट्रोपाउशन पर आधारित है जो पीएनए के लिए भ्रूण और प्रसवोत्तर दोनों जनकों के योगदान को ट्रैक करने की अनुमति देता है। सर्वव्यापक सी प्रमोटर (यूबीसी-स्टारट्रैक)पर निर्भर एक अद्यतनस्टारट्रैकयोजना तंत्रिका जनक15, 16,17के न्यूरोनल और ग्लियल वंश (एस्ट्रोसाइट्स शामिल) दोनों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की व्यापक अभिव्यक्ति प्राप्त करती है। हालांकि, इसके वर्तमान संस्करण में, इस दृष्टिकोण का कार्यान्वयन जटिल है, क्योंकि यह आंशिक उत्तेजन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप के साथ छह फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) व्यक्त करने वाले 12 अलग प्लाज्मिड्स के समान मिश्रण पर निर्भर करता है।
यहां प्रस्तुत एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन-आधारित मल्टीकलर लेबलिंग विधि में एक सीधा है जो कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स14को बाहर करने के लिए है। इसके अलावा, लाइसेंस प्राप्त (उदाहरण के लिए, इमारिस) और ओपन एक्सेस(Vaa3D18, 19,20)छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक आसान छवि विश्लेषण पाइपलाइन क्रमशः एस्ट्रोसाइट टेरिटोरियल वॉल्यूम और आर्बोराइजेशन को सेगमेंट करने के लिए प्रदान की जाती है। पहले वर्णित तरीकों की तुलना में, यह रणनीति पूरी तरह से 1-2 मल्टीकलर इंटीग्रेटिव ट्रांसजीन मल्टीड्रेसेबल जीनोम-इंटीग्रेटिंग कलर मार्कर (मैजिक मार्कर या एमएम21)पर निर्भर करती है, जिसका निर्देश साइटोप्लाज्मिक और (वैकल्पिक रूप से) परमाणु सेल डिब्बे को दिया जाता है जिसकी अभिव्यक्ति एक सिंथेटिक सीएजी प्रमोटर द्वारा संचालित होती है जिसमें साइटोमेगालोपायरस एनाउंसर शामिल होता है, चिकन β-ऐक्टिन प्रमोटर, और खरगोश β-ग्लोबिन स्प्लिस स्वीकार्य साइट22। यह भ्रूण से लेकर देर से प्रसवोत्तर चरणों तक कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की लेबलिंग और ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है, जो जीएफएपी अभिव्यक्ति14,23से स्वतंत्र है। इन ट्रांसजीन के प्रत्येक निम्नलिखित चार अलग एफपी भालू: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, और tdTomato/mCherry, जो ंयूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप है कि आसानी से 1 के साथ दरकिनार किया जा सकता है प्रदर्शित) अनुक्रमिक चैनल अधिग्रहण; 2) अनुकूलित उत्तेजन शक्ति और संग्रह लाभ; और 3) संकीर्ण एफपी उत्सर्जन खिड़कियों को इकट्ठा करने के लिए विशिष्ट डिक्रोइक फिल्टर। एमएम रणनीति एक सेलुलर आबादी में एफपी की स्टोचस्टिक अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक आत्म-उत्तेजनीय क्रे रिकॉम्बिनेस (एसईसीआर) के साथक्रे/लोक्स पुनर्संयोजन का उपयोग करती है। एमएम ट्रांसजीन की एक प्रति एफपी को पारस्परिक रूप से अनन्य तरीके से व्यक्त करती है, जबकि कई ट्रांसजीन एफपी संयोजनों को जन्म देते हैं, जिससे दर्जनों अलग-अलग रंग बनते हैं। ट्रांसजीन का जीनोमिक एकीकरण पिग्गीबाक (पीबी) या टोल2 ट्रांसपोजिशन सिस्टम24,25, 26से प्रेरितहोताहै। इसलिए, गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूशन, एमएम टूलकिट और मल्टीकलर ‘मोज़ेक’ के माध्यम से जो यह उत्पन्न करता है, लंबी अवधि में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स सहित कई आसन्न कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स के एक साथ अंकन और उनके ग्लियल वंश की ट्रैकिंग को सक्षम करता है। रंग पीआरए के समोच्च के विशिष्ट एफपी परमिट चित्रण की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप विरोधाभासों और बाद में उनके क्षेत्रीय मात्रा (IMARIS का उपयोग कर) और जटिल आकृति विज्ञान (Vaa3D का उपयोग कर) के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी निकालने । यहां विस्तार से प्रस्तुत बहुरंगी रणनीति एक सुविधाजनक और मजबूत विधि है जो विभिन्न विकासात्मक चरणों में जंगली प्रकार के चूहों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट सतह और आकृति विज्ञान तक त्वरित और आसान पहुंच प्रदान करता है, और ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों का उपयोग किए बिना न्यूरोलॉजिकल रोगों के माउस मॉडल में एस्ट्रोसाइट शारीरिक विशेषताओं की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स(चित्रा 1)में मैजिक मार्कर के यूटेरो इलेक्ट्रोपॉशन (आईयूई) में विभिन्न प्रसवोत्तर चरणों (पी 4-पी 7-पी 21, चित्रा 2)पर पोस्टनेटल सेरेब्रल कॉर्टेक्स में एस्ट्रोस?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए एस फौकेट और इंस्टीटयूट डी ला विजन और इंस्टीटयूट डेस न्यूरोसाइंस डी मोंटपेलियर (एमआरआई और रैम) की इमेजिंग और एनिमल कोर सुविधाओं का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को रेगियन इले-डी-फ्रांस और प्रियतम एआरसी से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ला रेचेचे सुर ले कैंसर से एस.C, और यूनीवर्सिट पेरिस-सैक्ले (पहल डॉक्टरेल्स इंटरडिसिपिलियर्स) से ला तक, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-एसजी 336331) से धन द्वारा, पीआई जे वैलेट) ईएच के लिए, एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे द्वारा अनुबंधों के तहत ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (फ्रांस बायोइमेजिंग) , प्रियतम द्वारा ला रेचेचे मेडिडेल (Ref. DBI20141231328), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-सीओजी 649117, पीआई जे लाइव) और एटीआईपी-एवेनियर प्रोग्राम (पीआई के Loulier) द्वारा।
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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