JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

Published: May 31, 2020
doi:
10.3791/61112
,
1Institute for Human Infections and Immunity,University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology,University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses,University of Texas Medical Branch

Summary

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti 蚊集団のベクター能力を決定することができる。

Abstract

提示された手順は、問題の蚊集団における感染率、播種感染、およびウイルスの潜在的な感染率を決定するために、実験室の条件下で Aedes aegypti 蚊をジカウイルスに感染させる一般的な方法論を記述する。これらの手順は、ベクター能力評価における様々な変更をグローバルに広く利用されています。彼らは、与えられた蚊(すなわち、種、集団、個体)が与えられた薬剤の伝達において果たす可能性のある役割を決定する上で重要である。

Introduction

ベクター能力は、種、集団、さらには個体のレベルでの能力として定義され、蚊、ダニ、またはフレボトミン砂飛のような与えられた節足動物の、節足動物1,2における複製または発生を伴う生物学的に薬剤を取得および伝達する。蚊および節足動物媒介ウイルス(すなわち、アルボウイルス)に関して、薬剤は雌の蚊によってビレミック宿主から浸透する。摂取後、ウイルスは、消化酵素によるタンパク質分解分解、微生物叢(ミドグ感染障壁、またはMIB)の存在、および分泌された腹膜マトリックスなどの様々な生理学的障害を克服し、中腸上皮細胞3の小集団の1つに生産的に感染しなければならない。中腸上皮の感染は、ウイルスの複製と最終的に蚊の開放的な循環系への中腸からの脱出、または中腸脱出障壁(MEB)を克服する播種感染の発症を表す血中リンパに続かなければならない。この時点で、ウイルスは二次組織(例えば、神経、筋肉、脂肪体)の感染を確立し、複製を続けることができますが、そのような二次複製は、ウイルスが唾液腺の体内細胞に感染する(唾液腺感染障壁を克服する)ために厳密に必要ではないかもしれません。唾液腺から補助的な空洞への出射口から唾液管への移動は、噛み付きの後続の宿主へのウイルスの接種を可能にし、伝達周期1、2、4、5、6、7を完了する。

このよく特徴づけられ、一般的に蚊ベクター内に広がるメカニズムが一般的に保存されていることを考えると、実験室のベクター能力評価はしばしば方法論的に類似しているが、プロトコルの違いは1,2である。一般的に、経口ウイルス暴露後、蚊は、ウイルス感染、播種感染、感染/潜在的なトランスリアル感染、および感染/潜在的な感染能力をそれぞれ8回受精させるため、中腸、脚、卵巣、唾液腺などの個々の組織をアッセイできるように解剖される。しかし、唾液腺にウイルスが存在することは、唾液腺脱出/出口バリア(SGEB)の証拠を与えられた1、2、4、5、7、9の伝達能力の決定的な証拠ではない。伝染能力を証明する標準的な方法は、感染の影響を受けやすい動物10、11、12への蚊の伝染のままである。しかし、多くのアルボウイルスでは、免疫不全マウスモデル13、14、15、16の使用が必要であることを考えると、この方法はしばしばコストが非常に高い。一般的に使用される代替手段は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)または感染性アッセイによって分析することができる蚊の唾液の採取であり、それぞれウイルスゲノムまたは感染性粒子の存在を実証する。このようなインビトロ唾液採取方法は、生体内給餌中に堆積したウイルスの量を12個過大評価または過小評価する可能性があり、そのようなデータは慎重に解釈しなければならないことを示している。しかし、インビトロ法は唾液中のウイルスの存在の観点から分析した場合に非常に価値が高く、感染の可能性を示す。

アルボウイルス性疾患の発生における蚊ベクターの役割を決定するための2つの主要なアプローチが存在する。最初の方法は、活動的な伝達18、19、20、21、22、23、24のコンテキストで蚊が収集されるフィールド監視を含みます。しかし、感染率が典型的には非常に低い(例えば、米国21の活動性ジカウイルス(ZIKV)循環地域における蚊の推定0.061%感染率)を考えると、潜在的な種の犯罪は、方法論25、26およびランダムな確率(例えば、1,600人の感染した個人をサンプリングする)によって大きく偏る可能性がある。.これを考慮して、特定の研究は、伝染に関与する蚊を正確にサンプリングするのに十分な生の数または種の多様性の両方で十分な蚊を獲得しない可能性があります。対照的に、ベクター能力分析は実験室で行われ、経口投与などのパラメータを厳密に制御することができます。蚊の感染と伝染能力の真の複雑さをフィールド環境で完全に表す能力はありませんが、これらの実験室評価はアーボビロ学の分野で強力なツールのままです。

いくつかの蚊種、集団、および方法27、28、29、30、31、32の様々なベクトル能力分析に基づいて、ベクター能力評価の最近のレビュー1、典型的なベクトル能力ワークフローに関連するプロトコルのいくつかをここで説明する。これらの実験では、南北アメリカ(サルバドール市、ブラジル、ドミニカ共和国、および米国の低リオグランデバレー、TX、米国)からの3つのAe.aegypti集団が、4、5、または6ログ10の焦点形成単位(FFU/m線量)でZIKV(Mex 1-7、GenBank加盟:KX247632.1)の単一株にさらされました。その後、外挿術の様々な時間(2、4、7、10、および14日間)の後に、解剖および細胞培養ベースの感染アッセイによって感染、播種感染、および伝染能力の証拠について分析した。現在のワークフロー/プロトコルはZIKV用に最適化されていますが、多くの要素は節足動物の封じ込めおよびバイオセーフティレベル2および3(ACL/BSL2またはACL/ BSL3)の他の蚊媒介性アルボウイルスに直接翻訳可能です。

Protocol

これらのプロトコルで行われたすべての手順は、ガルベストンのテキサス大学医学部の機関バイオセーフティ委員会および制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに完全に準拠して実行されました。 1. VERO細胞でZIKVを増幅 10%v/v熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)と1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mLおよび100 μg/mL)を補ったイーグルの最?…

Representative Results

Aeの3つの集団。 アメリカ大陸(サルバドール、ブラジル、ドミニカ共和国、およびリオグランデバレー、TX、米国)からの aegypti は、血液をベースにした血液中のチター(4、5、および6ログ10 FFU/mL)の範囲にわたって、アメリカ大陸(ZIKV Mex 1-7、チアパス州、メキシコ、2015)からのZIKVの発生株にさらされました。2日目、4日目、7日目、10日目、14日目に、蚊のサブセットを処理して感?…

Discussion

ここで説明する方法は、ベクトル能力分析を行う一般化されたワークフローを提供します。一般的な枠組みとして、これらの方法論の多くは文献全体に保存されています。しかし、変更の余地は大きくあります(AzarとWeaver1でレビュー)。ウイルス(例えば、ウイルス系統、チャレンジウイルスの保存、ウイルス通過歴)、昆虫学(例えば、蚊集団の実験室コロニー形成、先天性免…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、新興ウイルスおよびアルボウイルスのための世界参照センター(WRCEVA):ロバート・テッシュ博士、ヒルダ・グスマン、ケネス・プランテ博士、ジェシカ・プランテ博士、ディオンナ・シャルトン、ディヴィヤ・ミルチャンダニ博士が、私たちの他のグループのベクター能力実験に使用されるウイルス株の多くをキュレーションし、提供するたゆまぬ努力をしていることを認めます。提示された作品は、マクラフリン・フェローシップ・ファンド(SRA)とNIH助成金AI120942とAI121452によって資金提供されました。

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Here Are The Key Keywords From The Given Text: Vector CompetenceAedes AegyptiZika VirusArbovirusMosquitoesVector Competence AnalysesInfectious DiseasesVectorExperimentsInfected MosquitoesArthropod Containment FacilityBloodViral StockVero CellsInfectious Blood Meal
check_url/fr/61112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image