Mus Footpad Podulation Model til undersøgelse Viral-induceret Neuroinflammatory Responses
Summary
Den footpad vaccination model er et værdifuldt værktøj til at karakterisere viral-induceret neuroinflammatoriske reaktioner in vivo. Den giver især en klar vurdering af viral kinetik og tilhørende immunpatologiske processer, der er indledt i det perifere nervesystem.
Abstract
Denne protokol beskriver en footpad vaccination model, der anvendes til at studere indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion i mus. Som alphaherpesvirus er de vigtigste angribere af det perifere nervesystem (PNS), denne model er egnet til at karakterisere kinetik af viral replikation, dens spredning fra PNS til CNS, og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Den footpad vaccination model giver virus partikler til at sprede sig fra en primær infektion site i footpad epidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes via iskiasnerven til dorsale rod ganglier (DRG) og i sidste ende gennem rygmarven til hjernen. Her, en mus footpad er podet med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nært beslægtet med herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne model viser, at PRV-infektion inducerer alvorlig betændelse, karakteriseret ved neutrofil infiltration i footpad og DRG. Høje koncentrationer af inflammatoriske cytokiner påvises efterfølgende i homogeniserede væv ved ELISA. Desuden observeres en stærk korrelation mellem PRV-genet og proteinudtryk (via qPCR og IF farvning) i DRG og produktionen af proinflammatoriske cytokiner. Derfor, footpad vaccination model giver en bedre forståelse af de processer, der ligger til grund alfaherpesvirus-induceret neuropatier og kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. Desuden kan modellen guide forskning på perifere neuropatier, såsom multipel sklerose og tilhørende viral-induceret skade på PNS. I sidste ende kan det tjene som et omkostningseffektivt in vivo-værktøj til udvikling af lægemidler.
Introduction
Denne undersøgelse beskriver en footpad vaccination model til at undersøge replikation og spredning af virus fra PNS til CNS og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Fodplade-inokuleringsmodellen er blevet intensivt anvendt til at undersøge alfaherpesvirusinfektion i neuroner1,,2,3. Hovedformålet med denne model er at tillade neurotropiske vira til at rejse en maksimal afstand gennem PNS før de når CNS. Her, denne model bruges til at opnå nye indsigter i udviklingen af en bestemt neuropati (neuropatisk kløe) i mus inficeret med pseudorabies virus (PRV).
PRV er en alfaherpesvirus relateret til flere velkendte patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsager forkølelsessår, genitale læsioner og skoldkopper, henholdsvis4. Disse vira er alle pantropic og i stand til at inficere mange forskellige celletyper uden at vise affinitet for en bestemt vævstype. Men de udviser alle en karakteristisk neurotropisme ved at invadere PNS (og lejlighedsvis CNS) af værtsarter. Den naturlige vært er grisen, men PRV kan inficere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige værter, PRV inficerer PNS og inducerer en alvorlig kløe kaldet “gal kløe”, efterfulgt af perakuute død5,6. Den neuroimmune responss rolle i det kliniske resultat og patogenesensens rolle er blevet dårligt forstået.
Den footpad vaccination model giver PRV at indlede infektion i epidermale celler i footpad. Derefter, infektionen breder sig til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes ved viruspartikler bevæger sig via iskiasnerven til DRG inden for ca 60 h. Infektionen spredes gennem rygmarven, i sidste ende nå hindhjernen, når dyrene bliver døende (82 h post-infektion). I dette tidsrum kan vævsprøver indsamles, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponset. For eksempel kan histologisk undersøgelse og viral belastning kvantificering udføres i forskellige væv for at etablere sammenhænge mellem indledningen og udviklingen af kliniske, virologiske og neuroinflammatoriske processer i PRV patogenese.
Ved hjælp af fodblok-vaccinationsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismer i PRV-induceret kløe i mus undersøges. Desuden, denne model kan give ny indsigt i indledningen og udvikling af virus-induceret neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bedre forståelse af de processer, der ligger til grund for alfaherpesvirus-inducerede neuropatier, kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne model nyttig til at undersøge mekanismerne i neuropatisk kløe hos patienter med post-herpetiske læsioner (f.eks herpes zoster, helvedesild) og teste nye terapeutiske mål i mus for de tilsvarende sygdomme hos mennesker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den footpad vaccination model beskrevet her er nyttigt at undersøge indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion. Desuden er denne in vivo model bruges til at etablere kinetik af replikation og spredning af alphaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er en alternativ til andre vaccinationsmodeller, såsom flanke hud podning model, som bygger på dyb dermal ridser13, eller intrakraniel rute, som direkte indfører virus i CNS14<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Charles River laboratorier for deres fremragende teknisk støtte udfører histopatologi analyser. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
