Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites
Summary
Le modèle d’inoculation de la carte de pied est un outil précieux pour caractériser les réponses neuroinflammatoires induites par le virus in vivo. En particulier, il fournit une évaluation claire de la cinétique virale et des processus immunopathologiques associés initiés dans le système nerveux périphérique.
Abstract
Ce protocole décrit un modèle d’inoculation de pied-pad utilisé pour étudier l’initiation et le développement des réponses neuroinflammatoires pendant l’infection d’alphaherpesvirus chez la souris. Comme les alphaherpesvirus sont les principaux envahisseurs du système nerveux périphérique (PNS), ce modèle est approprié pour caractériser la cinétique de la réplication virale, sa propagation du PNS au SNC, et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la carte de pied permet aux particules virales de se propager d’un site d’infection primaire dans l’épiderme du pavé du pied aux fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares et le derme. L’infection se propage par l’intermédiaire du nerf sciatique aux ganglions de racine dorsale (DRG) et finalement par la moelle épinière au cerveau. Ici, un tapis de souris est inoculé avec le virus pseudorabies (PRV), un alphaherpesvirus étroitement lié au virus de l’herpès simplex (HSV) et au virus varicelle-zoster (VZV). Ce modèle démontre que l’infection de PRV induit l’inflammation grave, caractérisée par l’infiltration de neutrophile dans le pavé et le DRG. Des concentrations élevées de cytokines inflammatoires sont par la suite détectées dans les tissus homogénéisés par ELISA. En outre, une forte corrélation est observée entre le gène PRV et l’expression des protéines (via qPCR et si coloration) dans DRG et la production de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, le modèle d’inoculation de la piéillère permet de mieux comprendre les processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus et peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. En outre, le modèle peut guider la recherche sur les neuropathies périphériques, telles que la sclérose en plaques et les dommages induits par le virus associés à la PNS. En fin de compte, il peut servir d’outil in vivo rentable pour le développement de médicaments.
Introduction
Cette étude décrit un modèle d’inoculation de la paillère pour étudier la réplication et la propagation des virus du SNP au SNC et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la passerelle a été intensivement utilisé pour étudier l’infection à l’alphaherpesvirus dans les neurones1,2,3. L’objectif principal de ce modèle est de permettre aux virus neurotropes de parcourir une distance maximale à travers le PNS avant d’atteindre le SNC. Ici, ce modèle est utilisé pour obtenir de nouvelles idées dans le développement d’une neuropathie particulière (démangeaisons neuropathiques) chez les souris infectées par le virus pseudorabies (PRV).
Le PRV est un alphaherpesvirus lié à plusieurs agents pathogènes bien connus (c.-à-d. l’herpès simplex de type 1 et 2 [HSV1 et HSV2] et le virus varicelle-zoster [VZV]), qui causent respectivement des boutons de fièvre, des lésions génitales et lavaricelle, respectivement 4. Ces virus sont tous pantropes et capables d’infecter de nombreux types de cellules différents sans montrer d’affinité pour un type de tissu spécifique. Cependant, ils présentent tous un neurotropisme caractéristique en envahissant le PNS (et parfois, le SNC) des espèces hôtes. L’hôte naturel est le porc, mais le PRV peut infecter la plupart des mammifères. Dans ces hôtes non naturels, prv infecte le PNS et induit un prurit sévère appelé la « émite foll », suivie par la mort peracute5,6. Le rôle de la réponse neuroimmune dans les résultats cliniques et la pathogénie de l’infection de PRV a été mal compris.
Le modèle d’inoculation de la héliporte permet au PRV d’initier l’infection dans les cellules épidermiques du pavé. Ensuite, l’infection se propage dans les fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares, et le derme. L’infection se propage par des particules virales se déplaçant via le nerf sciatique au DRG dans environ 60 h. L’infection se propage par la moelle épinière, atteignant finalement le cerveau postérieur lorsque les animaux deviennent moribondes (82 h après l’infection). Pendant cette période, des échantillons de tissus peuvent être prélevés, traités et analysés pour la réplication du virus et les marqueurs de la réponse immunitaire. Par exemple, l’examen histologique et la quantification de charge virale peuvent être exécutés dans différents tissus pour établir des corrélations entre l’initiation et le développement des processus cliniques, virologiques, et neuroinflammatoires dans la pathogénie de PRV.
À l’aide du modèle d’inoculation du pavé de pieds, les mécanismes cellulaires et moléculaires du prurit induit par le PRV chez la souris peuvent être étudiés. En outre, ce modèle peut fournir un nouvel aperçu de l’initiation et le développement de la neuroinflammation induite par le virus pendant les infections à herpèsvirus. Une meilleure compréhension des processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. Par exemple, ce modèle est utile pour étudier les mécanismes de démangeaisons neuropathiques chez les patients présentant des lésions post-herpétiques (par exemple, herpès zoster, zona) et tester de nouvelles cibles thérapeutiques chez les souris pour les maladies humaines correspondantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle d’inoculation de la piétinement décrit ici est utile pour étudier l’initiation et le développement de réponses neuroinflammatoires pendant l’infection à alphaherpesvirus. En outre, ce modèle in vivo est utilisé pour établir la cinétique de la réplication et la propagation de l’alphaherpesvirus du PNS au SNC. Il s’agit d’une alternative à d’autres modèles d’inoculation, tels que le modèle d’inoculation de la peau du flanc, qui repose sur le grattage dermique profond<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent les laboratoires charles river pour leur excellent soutien technique exécutant les analyses d’histopathologie. Ces travaux ont été financés par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 et RO1 NS060699). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse de données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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