फ्लाईपब परख उन व्यवहारों को मापता है जो फल उड़ते हैं ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर इथेनॉल के प्रभाव में प्रदर्शित होता है। परख आसानी से सभी स्तरों पर प्रयोगकर्ताओं द्वारा महारत हासिल की जा सकती है और मादक द्रव्यों के सेवन और लत अध्ययन की सुविधा, विभिन्न वाष्पीकृत उत्तेजनाओं के लिए लागू किया जा सकता है।
शराब का उपयोग विकार (AUD) हमारे समाज में एक गंभीर समस्या बनी हुई है । लत के लिए प्रभावी हस्तक्षेप विकसित करने के लिए, अंतर्निहित न्यूरोबायोलॉजिकल तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है, जिसके लिए विविध प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और मॉडल सिस्टम की आवश्यकता है। मादक पेय पदार्थों का मुख्य घटक इथेनॉल है, जो पुरानी सेवन पर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और व्यवहार में अनुकूली परिवर्तन का कारण बनता है। व्यवहार संवेदीकरण (यानी, बढ़ी हुई प्रतिक्रियाएं) विशेष रूप से अंतर्निहित लत में एक प्रमुख अनुकूली परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करती है। पशु मॉडल में अधिकांश इथेनॉल-प्रेरित व्यवहार संवेदीकरण अध्ययन इथेनॉल के लोकोमोटर सक्रिय प्रभाव पर आयोजित किए गए हैं। इथेनॉल का एक प्रमुख प्रभाव व्यवहार निषेध है। इथेनॉल के निषेध प्रभाव के लिए व्यवहार संवेदीकरण, हालांकि, कम प्रतिनिधित्व किया जाता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हमने फ्लाईपब परख विकसित की है जो ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टरमें आवर्ती इथेनॉल एक्सपोजर पर बाधा वाली प्रेमालाप गतिविधियों में बढ़ी हुई वृद्धि को मापने की अनुमति देता है। यहां, हम इथेनॉल एक्सपोजर कक्षों की असेंबली, परख स्टेशन की स्थापना, फ्लाई केयर और संग्रह के लिए मानदंड, इथेनॉल डिलीवरी, डिस्टेंस कोर्टशिप गतिविधियों की मात्रा, डेटा प्रोसेसिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण सहित कदम-दर-कदम Flypub परख की रिपोर्ट करते हैं। इसके अलावा प्रदान की गई है कि कैसे महत्वपूर्ण कदम ों को परेशान करना है, सीमाओं पर काबू पाने और अतिरिक्त इथेनॉल-प्रेरित व्यवहार का आकलन करने के लिए इसकी उपयोगिता का विस्तार करना है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के संयोजन में फ्लाईपब परख इथेनॉल-प्रेरित व्यवहार संवेदीकरण अंतर्निहित तंत्र की खोज करने के कार्य को सुगम बनाएगा।
शराब दुनिया में सबसे आसानी से उपलब्ध और व्यापक रूप से खपत दवाओं में से एक है । इसमें दुरुपयोग और लत की उच्च क्षमता है; हालांकि, इस प्रक्रिया में अंतर्निहित तंत्र को अधूरा समझा जाता है। इथेनॉल अकशेरुकी, उत्साह, संज्ञानात्मक हानि, अतिसक्रियता, मोटर नियंत्रण की हानि और कीड़े में विच्छेदन को प्रेरित करता है1,फल मक्खियों1,,2,,3,चूहे4,चूहे5 और मनुष्य6,आम न्यूरोबायोलॉजिकल घटकों को अकशेरुकी से मनुष्यों सहित स्तनधारियों के लिए इथेनॉल के प्रभाव की मध्यस्थता का संकेत देते हैं। क्रोनिक इथेनॉल का सेवन तंत्रिका अनुकूलन और व्यवहार संशोधनों का कारण बनता है जो AUD को रेखांकित करते हैं। अनुकूलन ों में से एक व्यवहार संवेदीकरण है जिसे इथेनॉल7,8,9 या अन्य नशे की लत वालेपदार्थों 10,,11,12के बार – बार अनुभवों के साथ संवर्धित प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है ।
दशकों से, इथेनॉल-प्रेरित व्यवहार संवेदीकरण (एआईबीएस) पर अध्ययनों ने लोकोमोटर-उत्तेजक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसका उपयोग7,8,,9,,13पर एक जश्न प्रतिक्रिया के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता है।7 उदाहरण के लिए, चूहों या चूहों पर दोहराया (हर 24, 48 या 72 एच) इथेनॉल प्रशासन संवर्धित लोकोमोटर गतिविधि प्रदर्शित करता है जैसा कि गति8,,14,,,15,,16,17,,18,,19,,20,,21से मापा जाता है। इसी तरह, पहले एक्सपोजर के बाद इथेनॉल वाष्प 4 घंटे के दूसरे एक्सपोजर के अधीन फल मक्खियों ने बढ़ी हुई लोकोमोटर प्रतिक्रिया को गति के रूप में22चलने से मापा। जबकि फल मक्खियों में लोकोमोटर उत्तेजक प्रभाव के लिए एआईबीएस अंतर्निहित तंत्र पर कोई जानकारी उपलब्ध नहीं है, चूहों और चूहों में अध्ययनों ने आणविक और सिग्नलिंग घटकों (उदाहरण के लिए, डोपामाइन, ग्लूटामेट और गाबा सिस्टम) के साथ-साथ तंत्रिका सब्सट्रेट्स और सर्किट (उदाहरण के लिए, वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र, नाभिक एक्यूबेन्स, एमिग्डाला और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स) का पर्दाफाश किया है जो ईबीबीएस6,,9,,23के लिए प्रमुख भूमिकानिभाते हैं।
अहिचक इथेनॉल का एक प्रमुख प्रभाव है और व्यवहार की अभिव्यक्ति की ओर जाता है जो आमतौर पर प्रतिबंधित होते हैं। यह प्रभाव मोटर, भावनात्मक, सामाजिक, यौन और संज्ञानात्मक कार्यों पर लगाया जाता है, जिससे मनुष्यों और पशु मॉडलों में अनुचित यौन व्यवहार, मौखिक या शारीरिक आक्रामकता और आवेगी कृत्य हो सकते हैं24,,25,,26,,27,,28,,29। मशीनी अध्ययन के लिए पशु मॉडलों में इथेनॉल-प्रेरित निषेध की जांच की गई है और उनमें कृंतक और बंदरों में मोटर आवेगशीलता और आक्रामकता के साथ – साथ कीड़े6,9,,24,,28,29,,30में अहिचक को फोर्जिंग करना शामिल है । हमने दिखा दिया है कि फल मक्खियों इथेनॉल31के प्रभाव में यौन व्यवहार को बाधित दिखाते हैं । विशेष रूप से, जंगली प्रकार के पुरुष इथेनॉल31 के बिना शायद ही कभी अन्य पुरुषों को अदालत में उड़ते हैं और जब वे करते हैं, तो दरबारी सक्रिय रूप से पुरुषों को प्रणय निवेदन अस्वीकार करते हैं। इथेनॉल के प्रभाव में, हालांकि, पुरुष मक्खियां अन्य पुरुषों की ओर अधिक प्रणय निवेदन दिखाती हैं और शिरीण कम अस्वीकृति का प्रदर्शन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप समग्र रूप से बढ़ाया गया इंटरमाले प्रेमालाप होता है। विशेष रूप से, मक्खियों आवर्ती इथेनॉल एक्सपोजर पर अहिचक प्रभाव के लिए व्यवहार संवेदीकरण विकसित करते हैं, जो एआईबीएस31,,32का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी प्रणाली के रूप में कार्य करता है।
इस रिपोर्ट में, हम फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टरमें इथेनॉल-प्रेरित निषेध और संवेदीकरण का अध्ययन करने के लिए फ्लाईपब परख और डेटा की स्थापना, प्रदर्शन, समस्या निवारण और विश्लेषण करने का वर्णन करते हैं। इसकी उपयोगिता और प्रभावशीलता प्रदान करने के लिए, हमने जंगली प्रकार के कैंटन-एस (सीएस;नियंत्रण फ्लाई स्ट्रेन) के साथ-साथ टायरामिन में कमी आने वाली मक्खियों के साथ परीक्षण किया। ओए अकशेरुकी33,34 में एक प्रमुख न्यूरोमॉड्यूलेटर है और मक्खियों22में इथेनॉल सहिष्णुता के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हम यहां पहली बार रिपोर्ट करते हैं कि एआईबीएस के लिए ओए महत्वपूर्ण है ।
इस रिपोर्ट में, हमने फ्लाईपब परख के सेटअप और विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है; एक उपन्यास विधि को मापने के लिए कैसे आवर्ती इथेनॉल जोखिम बाधा प्रणय निवेदन और व्यवहार संवेदीकरण से चलाता है । हालांकि Flypub परख अपेक्षाकृत सीधा है, कई कदम विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए देखभाल और ध्यान की आवश्यकता है । सबसे पहले, परीक्षण के लिए मक्खियों को पूरी तरह से वर्णित किया जाना चाहिए (यानी, पूरी तरह से विकसित वयस्क मक्खियां), स्वस्थ और बरकरार। विकृति या नुकसान विशेष रूप से उनके पंखों या पैरों में पुरुष की अदालत की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । दूसरे, फ्लाई एज महत्वपूर्ण है और नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच मिलान किया जाना चाहिए (इष्टतम आयु: इथेनॉल एक्सपोजर 1 में 3-5 दिन पुरानी)। दो सप्ताह और पुराने जंगली प्रकार के पुरुष मक्खियों31disinhibited प्रणय निवेदन के ऊंचा स्तर प्रदर्शित करते हैं । इस प्रकार, परिवर्तनीय परिणामों से बचने के लिए अध्ययन के तहत मक्खियों की उचित आयु-मिलान आवश्यक है। तीसरे, पब प्रति फ्लाई नंबर महत्वपूर्ण है (इष्टतम: 33 प्रति पब)। पब प्रति कम या उच्च फ्लाई संख्या बहुत प्रेमालाप स्कोर (डेटा नहीं दिखाया) तिरछा कर सकते हैं। चौथा, फ्लाईपब कक्षों को चित्रा 2 Bमें सचित्र समान मात्रा की आवश्यकता होती है। यह सुनिश्चित करता है कि मक्खियों को इथेनॉल वाष्प समकालिक रूप से प्राप्त होता है और प्राप्त व्यवहार सुसंगत होते हैं। पांचवां, स्पष्ट वीडियो रिकॉर्डिंग और सटीक प्रणय निवेदन स्कोरिंग आवश्यक हैं । यह प्रोटोकॉल भारी व्यवहार टिप्पणियों पर निर्भर करता है, इसलिए मानकीकृत प्रेमालाप स्कोरिंग प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक पालन असंगत परिणामों को कम करने के लिए मौलिक है। अंत में, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि इथेनॉल एक्सपोजर और प्रेमालाप स्कोरिंग चरणों दोनों को आंख बंद करके किया जाए, जहां एक प्रयोगकर्ता फ्लाई जीनोटाइप या प्रयोगात्मक उपचार से अनजान है, जिससे प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह को रोका जा सके।
Flypub परख के कई फायदे हैं। सबसे पहले, मक्खियों के कई समूहों का परीक्षण और तुलना एक साथ की जा सकती है। दूसरे, यह सस्ती है, सेटअप करने के लिए सरल और सीखने के लिए आसान है, यह उच्च विद्यालय, स्नातक और स्नातक छात्रों, postdocs और संकाय के साथ ही सीमित अंतरिक्ष और बजट के साथ शिक्षण प्रयोगशालाओं के माध्यम से प्राथमिक सहित सभी स्तरों पर प्रयोगकर्ताओं के लिए अत्यधिक उत्तरदायी बना रही है । तीसरा, इसका उपयोग अतिरिक्त व्यवहारों को मापने के लिए किया जा सकता है जैसे कि मादा मक्खियों का अपहिचक प्रणय निवेदन और प्रारंभिक संवेदनशीलता और सहिष्णुता विकास और रखरखाव31,,32का आकलन करने के लिए इथेनॉल या अन्य शामक के शामक प्रभाव। साथ में, फ्लाईपब AUD की विविध विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी विधि है।
Flypub परख की प्रमुख सीमा कठोर और श्रमसाध्य प्रणय निवेदन आहार स्कोरिंग है । इथेनॉल के प्रभाव में प्रेमालाप व्यवहार इस तरीके से अत्यधिक गतिशील है कि प्रणय अवधि एक सेकंड से कम से कई मिनट तक होती है और प्रेमालाप में लगी मक्खियां अक्सर बदल जाती हैं। यहां प्रस्तुत स्कोरिंग शासन को इस गतिशील प्रकृति को शामिल करने और दिए गए जीनोटाइप31,32के लिए व्यक्तिगत इथेनॉल एक्सपोजर पर लगातार स्कोर प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था । जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, प्रेमालाप गतिविधि मैन्युअल रूप से अर्जित की जाती है, जो समय लेने वाली होती है। निष्पक्ष उच्च-थ्रूपुट व्यवहार स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए कई स्वचालित स्कोरिंग कार्यक्रम विकसित किए गए हैं और जिनमें से सभी व्यक्तिगत मक्खियों के आंदोलनों और,स्थानों39,40,,41,,42,43,,44,,45पर भरोसा करते हैं।, हमने स्वचालित रूप से प्रेमालाप गतिविधि को गिनने के लिए एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर विकसित करने का प्रयास किया लेकिन सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने में असमर्थ थे। यह इस तथ्य के कारण हो सकता है कि व्यवहार स्कोरिंग में कई प्रेमालाप चरण (यानी, निम्नलिखित, एकतरफा पंख विस्तार, पेट झुकने और बढ़ते)35,,36,,46 एक बार में कई मक्खियों शामिल हैं। यहां तक कि इस सीमा के साथ, पर्याप्त प्रशिक्षण के साथ एक प्रयोगकर्ता को स्थिरता और सटीकता के साथ इथेनॉल-प्रेरित प्रेमालाप व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होना चाहिए। फिर भी, मशीन लर्निंग या अन्य उन्नत एल्गोरिदम को अनुवर्ती के रूप में अपनाना बहुत मदद और महत्व होगा।
कृंतक मॉडल के समान, फ्लाई मॉडल में इथेनॉल पर अध्ययन ने काफी हद तक इथेनॉल के लोकोमोटर उत्तेजक और शामक प्रभावों पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, फ्लाईपब परख, प्रेमालाप को बाधित करता है, जो एक प्रकार का संज्ञानात्मक निषेध है जो उपन्यास31,32है। इसलिए, Flypub आणविक खिलाड़ियों, सेलुलर रास्तों और तंत्रिका सर्किट के साथ-साथ जोखिम कारकों (जैसे, उम्र, नींद, आहार या सामाजिक वातावरण) को व्यवहार निषेध और संवेदीकरण के लिए महत्वपूर्ण स्पष्ट करने में सहायता कर सकता है। हमने पहले यह दर्शाया है कि एआईबीएस के लिए डोपामाइन सिग्नलिंग की आवश्यकता है, जो कृंतक मॉडल ों और मानव विषयों6,,9,,31में निष्कर्षों के अनुरूप है । इसके अलावा अवधारणा के सबूत के रूप में, हमने ओए (नोरेपिनेफ्रीन के अकशेरुकी समकक्ष) की कमी वाले टीएच उत्परिवर्ती की जांच की और पाया कि ओए इथेनॉल के निषेध प्रभाव के व्यवहार संवेदीकरण के लिए भी महत्वपूर्ण है, हालांकि इसका योगदान डोपामाइन31की तुलना में अपेक्षाकृत छोटा है। यह निष्कर्ष शोल्ज़47 के अवलोकन के विपरीत है कि टीएच उत्परिवर्ती मक्खियां इथेनॉल के लोकोमोटर सक्रिय प्रभाव47को संवेदीकरण में कोई स्पष्ट हानि नहीं देती हैं। यह अलग आणविक, सेलुलर और तंत्रिका मार्ग ों को लोकोमोटर सक्रियण बनाम अहिचक के व्यवहार संवेदीकरण में मध्यस्थता करने का सुझाव देता है। अनुवर्ती अध्ययनों को इस धारणा को और सहयोग करना चाहिए ।
संक्षेप में, Flypub इथेनॉल, विशेष रूप से अहिचक और व्यवहार संवेदीकरण के व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए एक कम लागत, बहुआयामी और प्रभावी तरीका है, जो AUD की हमारी समझ को आगे बढ़ाने और इस पुरानी विकार के लिए प्रभावी हस्तक्षेप में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन NARSAD, और NIMHD 2G12MD007592 NMD क्लस्टर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम एनएमडी और सीएमएस का समर्थन करने के लिए एनआईएच-वित्त पोषित राइज प्रोग्राम (एनआईआईएमएस 5R25GM069621) के आभारी भी हैं, एनएमडी का समर्थन करने के लिए यूटीईपी कोउरी-पार कार्यक्रम, एनआईडीएच-वित्त पोषित मार्क कार्यक्रम (एए का समर्थन करने के लिए एनआईएच 2T34GM08048-31) और ईबीएस का समर्थन करने के लिए डॉ कीलुंग हांग ग्रेजुएट फेलोशिप। हम बहुत UTEP संचार विभाग की सराहना करते हैं: डार्लीन Barajas, क्रिश्चियन रिवेरा, करीना मोरेनो, जोस लोया फर्नांडीज और संगीत विभाग: स्टीफन ए हद्दाद वीडियो और आवाज पर उत्पादन में उनकी मदद के लिए । अंत में, हम नियंत्रण कैंटन-एस मक्खियों के साथ कैंटन-एस पृष्ठभूमि में टीएच उत्परिवर्ती साझा करने के लिए डॉ एंड्रियास थम के बहुत आभारी हैं; और जेसिका Burciaga ऑक्टोपामाइन और चर्चा और समर्थन के लिए हान लैब के सदस्यों पर प्रारंभिक अध्ययन के लिए उसे मूल्यवान योगदान के लिए ।
95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
Canton-S | – | – | wild-type strain used as a control |
Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
Excel | Microsoft | – | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
Microsoft LifeCam software | Microsoft | – | version 3.60; to videotape flypubs |
Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
Minitab 17 | Minitab | – | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | – | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
Plastic funnel – mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
Plastic funnel – small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
Polycarbonate sheet | Lexan | – | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
Time code | – | – | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
Tyramine b hydroxylase (tbh) | – | – | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
VLC media player | VideoLAN | – | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |