Høyoppløselig kartlegging av protein-DNA interaksjoner i mus stamcelle-avledede nevroner ved hjelp av kromatin immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)
Summary
Nøyaktig bestemmelse av proteinbindende steder på tvers av genomet er viktig for å forstå genregulering. Her beskriver vi en genomisk kartleggingsmetode som behandler kromatin-immunoprecipitated DNA med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering. Denne metoden oppdager protein-DNA-interaksjoner med nær base-pair kartløsning og høyt signal-til-støy-forhold i pattedyrnevroner.
Abstract
Identifisering av spesifikke protein-DNA interaksjoner på genomet er viktig for å forstå genregulering. Kromatinimmunoprecipitation kombinert med høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) er mye brukt til å identifisere genom-wide bindende steder av DNA-bindende proteiner. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrenset av heterogeniteten i lengden av sonikerte DNA-fragmenter og ikke-spesifikk bakgrunns-DNA, noe som resulterer i lav kartløsning og usikkerhet i DNA-bindende steder. For å overvinne disse begrensningene benytter kombinasjonen av ChIP med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) 5′ til 3′ exonuclease fordøyelsen for å trimme den heterogeneouststore immunoprecipitated DNA til protein-DNA crosslinking site. Exonuclease behandling eliminerer også ikke-spesifikk bakgrunn DNA. Bibliotek-forberedt og exonuclease-fordøyd DNA kan sendes for høy gjennomstrømning sekvensering. ChIP-exo-metoden muliggjør nær base-pair kartløsning med større deteksjonsfølsomhet og redusert bakgrunnssignal. En optimalisert ChIP-exo-protokoll for pattedyrceller og neste generasjons sekvensering er beskrevet nedenfor.
Introduction
Plasseringen av protein-DNA interaksjoner gir innsikt i mekanismene for genregulering. Kromatin immunoprecipitation kombinert med høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) har blitt brukt i et tiår for å undersøke genom-wide protein-DNA interaksjoner i levendeceller 1,2. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrenset av heterogenitet i DNA-fragmentering og ubundet DNA-kontaminering som fører til lav kartløsning, falske positiver, tapte anrop og ikke-spesifikt bakgrunnssignal. Kombinasjonen av ChIP med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) forbedrer chip-seq-metoden ved å trimme ChIP DNA til protein-DNA crosslinking poeng, og gir nær base-pair oppløsning og et lavt bakgrunnssignal3,4,5. Den sterkt forbedrede kartleggingsoppløsningen og lav bakgrunn fra ChIP-exo gjør det mulig å bestemme nøyaktige og omfattende protein-DNA-bindende steder på tvers av genomet. ChIP-exo er i stand til å avsløre funksjonelt distinkte DNA-bindende motiver, samarbeidende interaksjoner mellom transkripsjonsfaktorer (TF) og flere protein-DNA krysskoblingssteder på et bestemt genomisk bindende sted, ikke påviselig ved andre genomiske kartmetoder3,4,6,7.
ChIP-exo ble opprinnelig brukt i spirende gjær for å undersøke sekvensspesifikk DNA-binding av TFs, for å studere den nøyaktige organiseringen av transkripsjonskomplekset før initieringskomplekset, og subnukleosomal struktur av individuelle histoner overgenomet 4,8,9. Siden introduksjonen i 20114har ChIP-exo blitt brukt i mange andre organismer, inkludert bakterier, mus og menneskeligeceller 7,10,11,12,13,14,15,16,17. I 2016 brukte Rhee et al.14 ChIP-exo i pattedyrnevroner for første gang for å forstå hvordan nevronalt genuttrykk ble opprettholdt etter nedreguleringen av programmering TF Lhx3, som danner et heterodimerkompleks med en annen programmering TF Isl1. Denne studien viste at i fravær av Lhx3 rekrutteres Isl1 til nye nevronale enhancers bundet av Onecut1 TF for å opprettholde genuttrykk av nevronale effektorgener. I denne studien avslørte ChIP-exo hvordan flere TFs dynamisk gjenkjenner celletype og cellestadsspesifikke DNA-regulatoriske elementer på en kombinatorisk måte ved nærkjerneotidkartløsning. Andre studier brukte også ChIP-exo-metoden for å forstå samspillet mellom proteiner og DNA i andre pattedyrcellelinjer. Han et al.7 brukte ChIP-exo til å undersøke genomet-wide organisering av GATA1 og TAL1 TFs i mus erythroid celler ved hjelp av ChIP-exo. Denne studien fant at TAL1 er direkte rekruttert til DNA i stedet for indirekte gjennom protein-protein interaksjoner med GATA1 gjennom erythroid differensiering. Nyere studier brukte også ChIP-exo til å profilere genomomfattende bindingssteder av CTCF, RNA Polymerase II og histonemerker for å studere epigenomiske og transkripsjonelle mekanismer i menneskeligecellelinjer 18,19.
Det finnes flere versjoner av ChIP-exo-protokollen tilgjengelig3,5,20. Disse ChIP-exo-protokollene er imidlertid vanskelige å følge for undersøkelser som ikke er kjent med neste generasjons sekvenseringsbibliotekforberedelse. En utmerket versjon av ChIP-exo-protokollen ble publisert med enkle å følge instruksjoner og en video21, men inneholdt mange enzymatiske trinn som krever en betydelig mengde tid å fullføre. Her rapporterer vi en ny versjon av ChIP-exo-protokollen som inneholder reduserte enzymatiske trinn og inkubasjonstider, og forklaringer for hvert enzymatisketrinn 21. Sluttreparasjon og dA-tailing reaksjoner kombineres i et enkelt trinn ved hjelp av end prep enzymet. Inkubasjonstidene for indeks- og universaladapter ligation trinn reduseres fra 2 t til 15 min ved hjelp av en ligation enhancer. Kinasereaksjonen etter indeksadapterens ligationtrinn som er beskrevet i den forrige ChIP-exo-protokollen, fjernes. I stedet tilsettes en fosfatgruppe under oligo DNA-syntese til en av de 5′ endene av indeksadapteren (tabell 1), som vil bli brukt til lambda exonuclease fordøyelsestrinn. Mens den forrige ChIP-exo-protokollen brukte RecJf exonuclease fordøyelsen for å eliminere single-stranded DNA forurensninger, dette fordøyelsestrinnet fjernes her fordi det ikke er avgjørende for kvaliteten på ChIP-exo biblioteket. I tillegg, for å rense omvendt krysskoblet DNA etter ChIP-elitasjon, brukes en magnetisk perler rensemetode i stedet for fenol:kloroform:isoamylalkohol (PCIA) ekstraksjonsmetode. Dette reduserer inkubasjonstiden for DNA-ekstraksjon. Viktigere, det fjerner flertallet av adapter dimers dannet under indeks adapter ligation, noe som kan påvirke effektiviteten av ligation-mediert PCR.
ChIP-exo-protokollen som presenteres her er optimalisert for påvisning av presise protein-DNA-interaksjoner i pattedyrnevroner differensiert fra mus embryonale stamceller (ES). Kort, høstet og krysskoblet neuronal celler er lysed, slik at kromatin å bli utsatt for sonikering, deretter sonikert slik at riktig størrelse DNA fragmenter oppnås (Figur 1). Antistoffbelagte perler brukes deretter til selektivt immunprecipitate fragmentert, oppløselig kromatin til protein av interesse. Mens immunforeskrivet DNA er fortsatt på perlene, end-reparasjon, ligation av sekvensering adaptere, fill-in reaksjon og 5 ‘ til 3 ‘ lambda exonuclease fordøyelsen trinn utføres. Det eksonukleære fordøyelsestrinnet er det som gir ChIP-exo sin ultrahøy oppløsning og høyt signal-til-støy-forhold. Lambda exonuclease trimmer immunprecipitated DNA noen base-par (bp) fra krysskoblingsstedet, og dermed forårsaker forurensende DNA å bli degradert. Det eksonukleære ChIP DNA er eluted fra antistoffbelagte perler, protein-DNA krysskoblinger reverseres, og proteiner brytes ned. DNA ekstraheres og denatureres til en strandet ChIP DNA, etterfulgt av primer annealing og forlengelse for å lage dobbelttrådet DNA (dsDNA). Deretter utføres ligation av en universell adapter til de eksonuklelebehandlede endene. Det resulterende DNA renses, deretter PCR forsterket, gel renset, og utsatt for neste generasjons sekvensering.
ChIP-exo-protokollen er lengre enn ChIP-seq-protokollen, men er ikke veldig teknisk utfordrende. Enhver vellykket immunprecipitated ChIP DNA kan bli utsatt for ChIP-exo, med flere ekstra enzymatiske trinn. De bemerkelsesverdige fordelene med ChIP-exo, for eksempel ultrahøy kartleggingsoppløsning, et redusert bakgrunnssignal og reduserte falske positive og negativer, angående genomiske bindingssteder, oppveier tidskostnadene.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen brukes ChIP etterfulgt av exonuclease fordøyelse til å skaffe DNA-biblioteker for identifisering av protein-DNA-interaksjoner i pattedyrceller ved ultrahøy kartleggingsoppløsning. Mange variabler bidrar til kvaliteten på ChIP-exo-eksperimentet. Kritiske eksperimentelle parametere inkluderer kvaliteten på antistoffer, optimalisering av sonikering, og antall LM-PCR sykluser. Disse kritiske eksperimentelle parametrene er også det som kan begrense ChIP-exo eksperimenter og vil bli diskutert nedenfo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmet av Rhee-laboratoriet for å dele upubliserte data og verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) stipend RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L., A, J. e. l. t. s. c. h., Rots, M. G. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
