हम पाचन बफर में अनुक्रमिक ऊतक पाचन के माध्यम से चूहे के दिलों से एंडोकार्डियल और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, आवर्ती अपकेंद्रित्र चक्रों से सेल संग्रह, और एंटी-रैट सीडी 31 माइक्रोमोतियों का उपयोग करके सेल शुद्धि।
यह दिखाया गया है कि एंडोकार्डियल एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईईसी) और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाएं (सीईसी) मूल, विकास, मार्कर और कार्यों में भिन्न होती हैं। नतीजतन, ये दोनों सेल आबादी हृदय रोगों में अनूठी भूमिका निभाती है। अलग-थलग करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं से जुड़े वर्तमान अध्ययन ईईसी और सीईसी दोनों से मिलकर सेल आबादी की जांच करते हैं। यह प्रोटोकॉल सेल-विशिष्ट लक्षण वर्णन के लिए इन दो सेल आबादी को स्वतंत्र रूप से अलग करने की एक विधि को रेखांकित करता है। बाएं और दाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार के संग्रह के बाद, बाहरी सतह और आंतरिक सतह से एंडोथेलियल कोशिकाओं को पाचन बफर समाधान का उपयोग करके अलग से मुक्त किया जाता है। बाहरी सतह के अनुक्रमिक पाचन और आंतरिक एंडोकार्डियल परत ने दो एंडोथेलियल सेल आबादी के अलगाव को बनाए रखा। प्रत्येक आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर की पहचान के माध्यम से ईईसी और सीईसी के अलग अलगाव को और सत्यापित किया जाता है । माउस दिल में पहले से प्रकाशित एकल सेल आरएनए प्रोफाइलिंग के आधार पर, एनपीआर 3, हैप्लन1और सीडीएच11 जीन अभिव्यक्ति ईईसी के लिए अद्वितीय है; जबकि फैब4, एमजीएलऔर सीडी36 जीन अभिव्यक्ति सीईसीएस के लिए अद्वितीय है। क्यूपीसीआर डेटा ने अपने-अपने नमूनों में इन विशिष्ट मार्कर की समृद्ध अभिव्यक्ति का खुलासा किया, जो सफल ईईसी और सीईसी अलगाव का संकेत देता है, साथ ही सेल फेनोटाइप का रखरखाव, आगे सेल-विशिष्ट कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करता है।
यह लेख चूहे के दिलों से एंडोकार्डियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईईसी) और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) के विच्छेदन और बाद के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल (ग्लैडका एट अल1से संशोधित) प्रदान करता है। इन सेल आबादी की स्वतंत्र रूप से जांच करने की क्षमता हृदय रोगों की एक किस्म है कि संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में सेवा कर सकता अंतर्निहित सेल प्रकार विशिष्ट तंत्र की खोज सक्षम होगा । इन सेल आबादी के संग्रह के लिए स्वतंत्र रूप से एक सफल तरीका अभी तक प्रकाशित किया जाना है, लेकिन ।
सीईसीएस ईईसी से हृदय विकास और,रोग,,1,,2,23,4,5,6,,7के दौरान उनके मूल, मार्कर और कार्यों के संबंध में ईईसी से भिन्न होता है। ईईसी कार्डियक मेसोडरम3की वेंट्रल सतह से स्टेम करते हैं । वे VEGF और HIF सिग्नलिंग के जवाब में Flk1+ जनक कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और विकासशील दिल के तीन असतत क्षेत्रों की अंतरतम परत बनाते हैं: एट्रियम, वेंट्रिकल, और पापनस नॉयसस3,,6। जेनेटिक वंश अनुरेखण से पता चलता है कि सिनोस वेनसस की प्लुरीशक्तिशाली एंडोकार्डियल कोशिकाएं वेष्म कोशिकाओं को प्राप्त करती हैं, जो सबपिकार्डियल लेयर3बनाने के लिए माइग्रेट होती हैं। इसके बाद, उपपिकार्डियल परत सीईसी सहित कोरोनरी धमनियों और नसों में अंतर करती है, जो परिधीय वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार3,,4के पार रहती है। एंडोथेलियल पाथवे के लिए यह एंडोकार्डियल VEGFC, ईला/एपीजे, और SOX17 सिग्नलिंग3,,4,,6,,8,,9द्वारा विनियमित है । वेंट्रिकुलर एंडोकार्डियम एक अज्ञात तंत्र द्वारा इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम के कम सीईसी प्राप्त करता है3। इसके बाद, ईईसी और सीईसी के बीच स्थानीयकृत विभेदन का सुझाव इन दो सेल आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर द्वारा दिया जाता है, जिसमें एमजीएल, फैब4 और सीईसी में सीडी36 अभिव्यक्ति, या एनपीआर 3, सीडी11 और ईईसी3,5,5,10 में हैप्लन 1 अभिव्यक्तिशामिलहै।
ईईसी और सीईसी कार्डियक फंक्शन में अलग-अलग भूमिकानिभाते हैं। मेसेंचिमल संक्रमण, वाल्व गठन, कक्ष परिपक्वता, बहिर्वाह पथ विनियमन, और एट्रिवेनेट्रिकुलर नहर विकास ईईसी6पर आकस्मिक हैं। वैकल्पिक रूप से, सीईसीएस वासोमोटर टोन और कोरोनरी धमनियों11की सूजन में योगदान देते हैं। इन विचरण के परिणामस्वरूप रोग विकास4,12में व्यक्तिगत भूमिकाएं होती हैं . उदाहरण के लिए, सबूत ों से पता चलता है कि खराब होने से ईईसी जन्मजात वाल्व रोग6,नॉनकॉम्पक्शन मायोकार्डियम6,एट्रिओवेन्ट्रिकुलर सेप्टल इफेक्ट6,एंडोकार्डियल फाइब्रोलेस्टेरोसिस13,हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम13,वेंट्रिकुलर हाइपोप्लासिया13और कार्डियक हाइपरट्रॉफी12हो सकता है । इसी तरह, अध्ययनों में पाया गया है कि असामान्य सीईसी कोरोनरी धमनी रोग14 और थ्रोम्बोसिस11में योगदान देते हैं ।
इन दो सेल आबादी के व्यापक ज्ञान को प्राप्त करने के लिए ईईसी और सीईसी का सफल अलगाव आवश्यक है, जिसका उपयोग अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में किया जा सकता है। इन सेल आबादी के विकास और भेदभाव कारकों का निर्धारण प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से एंडोथेलियल उपप्रकारों के भेदभाव के लिए एक संदर्भ प्रदान करेगा । इसके अलावा, ईईसी और सीईसी के विकास, विनियमन और कार्य में भिन्नताओं की पूरी पहचान कोशिका प्रकार-विशिष्ट तरीके से कई हृदय रोगों के लिए जिम्मेदार जीनोमिक और एपिजेनोमिक कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यह लेख स्वतंत्र रूप से ईईसी और सीईसी के सफल संग्रह के लिए कदमों की रूपरेखा तैयार करता है, और सेल प्रकार-विशिष्ट मार्कर के जीन अभिव्यक्ति स्तरों का आकलन करके अलगाव के सबूत प्रदान करता है।
सीईसीएस और ईईसी मूल, मार्कर और कार्यों में भिन्न होते हैं, और इस प्रकार विकास और रोग में अद्वितीय भूमिका निभा सकते हैं। एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल मैक्रोवस्कुलर ऊतकों तक सीमित हैं, ईईसी के संग्रह की उपेक्षा करते हैं, इस प्रकार सीईसी और ईईसी-विशिष्ट कार्यों के अध्ययन को सीमित करते हैं। इन दोनों आबादी को स्वतंत्र रूप से अलग-थलग और अध्ययन करना आवश्यक है, क्योंकि यह ज्ञान भविष्य के अध्ययनों के लिए आईसीईसी और ईईसी में आईपीएससी के भेदभाव के लिए एक संदर्भ प्रदान करेगा और विभिन्न हृदय रोगों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए इन कोशिका आबादी की जांच को सुगम बनाएगा । यह उपन्यास प्रोटोकॉल वयस्क चूहों की वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार की बाहरी सतह से आंतरिक सतह और सीईसीएस से ईईसी के अलगाव के लिए एक विधि तैयार करता है।
इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण के लिए समय को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। क्योंकि चूहे के दिल के ऊतकों में ईईसी की संख्या बहुत सीमित है, हमने सेलुलर क्षति को रोकने के लिए दिल की आंतरिक परत के पाचन समय को कम किया और अधिक महत्वपूर्ण बात, सीईसी संदूषण। एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए ईसी माध्यम समाधान के तत्काल अलावा उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है। एक लाल गोली के बाद सेल संग्रह आरबीसी की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति का सुझाव देता है । आरबीसी संदूषण की मात्रा के आधार पर, आरबीसी लिसिस बफर के 1-2 mL को आरबीसी को नीचा दिखाने के लिए जोड़ा जा सकता है । कोशिकाओं को महत्वपूर्ण नुकसान से बचने के लिए इनक्यूबेशन को सावधानीपूर्वक समय पर जोड़ा जाना चाहिए, और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए पीबीएस को तुरंत जोड़ा जाता है । वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम छह चूहे के दिलों से 105 ईईसी को अलग करने में सक्षम थे। इन कोशिकाओं को आगे विस्तार और लक्षण वर्णन के लिए एक सेल संस्कृति पकवान पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है ।
मुफ्त दीवार संग्रह के लिए ऊतक तैयार करते समय, शेष आरडीसी के बहुमत को हटाने के लिए दिल को एचबीएसएस के साथ धोया गया था। एचबीएसएसएस अपनी स्पष्ट उपस्थिति के कारण अनुशंसित माध्यम है, जो फेनोल लाल युक्त डीएमईडी के विपरीत रक्त कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। पाचन बफर की संरचना एंडोथेलियल कोशिकाओं की पर्याप्त मुक्ति सुनिश्चित करती है, जहां लिबरेज पाचन एंजाइम उजागर कोशिकाओं के ऊतकों को स्ट्रिप्स करता है, DNase मैं मृत कोशिकाओं से डीएनए को समाप्त करता है ताकि डीएनए की चिपकने वाली गुणवत्ता से बाधित होने वाली कोशिका टुकड़ी को बढ़ावा दिया जा सके, HEPES बफर पीएच को संतुलित करता है, और डीएमईएम एक संशोधित बेसल माध्यम है जिसमें बेहतर सेल रखरखाव के लिए अमीनो एसिड और विटामिन की उच्च एकाग्रता होती है और इसमें लिबरेज को सक्रिय करने के लिए आवश्यक कैल्शियम होता है।
मानव15 और माउस हार्ट10दोनों से प्राप्त एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) के अनुसार, विशिष्ट ईसी आबादी के लिए जिम्मेदार कई मार्कर की सूचना दी गई थी। हमने अलग-थलग ईईसी (यानी एनपीआर3, सीडी11,और हैप्लन1)और ईईसी (यानी, एमजीएल, फैब4और सीडी36)की शुद्धता की जांच करने के लिए कुछ सबसे समृद्ध जीन का चयन किया। सीईसी कीतुलना में ईईसी मेंएक्सेलिन, एनपीआर 3, सीडीएच11और हैप्लन1 मार्कर के सापेक्ष वृद्धि अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। इसी तरह, ईईसी की तुलना में सीईसी में एमजीएल, फैब4और सीडी36 मार्कर की अभिव्यक्ति अधिक थी। प्रत्येक नमूने के लिए विशिष्ट रूप से व्यक्त किए गए मार्कर क्रमशः ईईसी और सीईसी के लिए विशेषता मार्कर के अनुसार है, जो सफल अलगाव का संकेत देता है।
हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव के दौरान दो चुनाव आयोग की आबादी के बीच क्रॉस संदूषण से इंकार नहीं कर सकता, यहां तक कि सावधानी से नियंत्रित अनुक्रमिक पाचन के साथ। इसलिए, आगे शुद्धिकरण के लिए कुछ सेल सतह मार्कर लागू किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, एनपीआर 3 आम तौर पर एंडोकार्डियम10को लेबल करता है, जबकि एपीजे अधिकांश सीईसी16का पता लगा सकता है। क्योंकि इन दो मार्कर सेल की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं, वे फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एंटीबॉडी आगे अलग चुनाव आयोग आबादी को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया । इसके अलावा, मानव15 और माउस10 दिल स्क्रैना-सीक्यू ईईसी में एनपीआर 3 के संवर्धन की पुष्टि कर सकता है, और सीडी36 का संभावित रूप से सीईसी शुद्धिकरण के लिए उपयोग किया जा सकता है।
निष्कर्ष में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहे के दिल से EECs और CECs के स्वतंत्र अलगाव की रूपरेखा । सेल अलगाव द्वारा सक्षम सेलुलर गुणों की व्यापक पहचान, महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक पशु प्रोटोकॉल के साथ उसकी मदद के लिए डॉ Lingli वांग की बहुत सराहना करते हैं, और बुनियादी सुविधाओं के समर्थन के लिए स्टैनफोर्ड में बाल रोग विभाग । इस काम को एनआईएच/एनएचएलबीआई के99 एचएल135258 (एमजी) ने सपोर्ट किया।
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
S&T Forceps – SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
Vannas Spring Scissors – Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |