عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية
Summary
يوضح هذا البروتوكول 1) عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة وكذلك 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي جنبا إلى جنب مع تدرجات كثافة السكروز تليها تحليلات اللطخة الغربية.
Abstract
الإكسوسومات هي حويصلات صغيرة خارج الخلية تفرزها جميع الخلايا تقريبا وتفرز في جميع السوائل الحيوية. تم تطوير العديد من الطرق لعزل هذه الحويصلات ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ومع ذلك ، ليست كلها مناسبة لتنقية وتوصيف exosome على نطاق واسع. يوضح هنا بروتوكول لإنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية المعزولة من عضلات الهيكل العظمي للفأر البالغ ، يليه تنقية وتوصيف الإكسوسومات من وسائط زراعة هذه الخلايا. تعتمد الطريقة على استخدام خطوات الطرد المركزي المتسلسلة متبوعة بتدرجات كثافة السكروز. ثم يتم التحقق من نقاء المستحضرات الخارجية من خلال تحليلات اللطخة الغربية باستخدام بطارية من العلامات الكنسية (مثل Alix و CD9 و CD81). يصف البروتوكول كيفية عزل وتركيز الإكسوسومات النشطة بيولوجيا للمجهر الإلكتروني ، وقياس الطيف الكتلي ، وتجارب الامتصاص للدراسات الوظيفية. يمكن بسهولة توسيع نطاقه أو تقليله وتكييفه لعزل الإكسوسوم من أنواع الخلايا والأنسجة والسوائل البيولوجية المختلفة.
Introduction
Exosomes هي حويصلات خارج الخلية غير متجانسة يتراوح حجمها من 30-150 نانومتر. يتم تأسيسها لاعبين رئيسيين في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، بالنظر إلى توزيعها في كل مكان في الأنسجة والأعضاء 1,2. تحمل الإكسوسومات شحنة معقدة من البروتينات والدهون وأنواع الحمض النووي وأنواع الحمض النووي الريبي ، والتي تختلف وفقا لنوع الخلايا التي اشتقت منها1،2،3. يتم إثراء الإكسوسومات في البروتينات التي لها وظائف مختلفة (أي أن التتراسبانين ، بما في ذلك CD9 و CD63) هي المسؤولة عن أحداث الاندماج. على سبيل المثال ، تشارك بروتينات الصدمة الحرارية HSP70 و HSP90 في ربط المستضد وعرضه. بالإضافة إلى ذلك ، يشارك Alex و Tsg101 والأسطول في التكوين الحيوي للإكسوسوم وإطلاقه ويستخدم على نطاق واسع كعلامات لهذه الحويصلاتالنانوية 2،3،4.
تحتوي الإكسوسومات أيضا على مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي (مثل الحمض النووي الريبي الميكروي ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي) التي يمكن نقلها إلى الخلايا المتلقية ، حيث تؤثر على إشارات المصب3. نظرا لكونه محاطا بغشاء وحدة واحدة ، فإن النشاط الحيوي الخارجي لا يعتمد فقط على شحنة البروتينات والأحماض النووية ، ولكن أيضا على المكونات الدهنية للغشاء المحدد1. يتم إثراء الأغشية الخارجية بالفوسفاتيديل سيرين وحمض الفوسفاتيديك والكوليسترول والسفينغوميلين وحمض الأراكيدونيك والأحماض الدهنية الأخرى ، وكلها يمكن أن تؤثر على استقرار الإكسوسوم وطوبولوجيا الغشاء 2,3. نتيجة لترتيب الشحن والدهون ، تبدأ الإكسوسومات مسارات الإشارات في الخلايا المستقبلة وتشارك في الحفاظ على فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية1،2،4،5. في ظل ظروف مرضية معينة (مثل التنكس العصبي والتليف والسرطان) ، فقد ثبت أنها تحفز وتنشر المحفزات المرضية4،6،7،8،9،10،11.
نظرا لقدرتها على نشر الإشارات إلى المواقع المجاورة أو البعيدة ، أصبحت exosomes مؤشرات حيوية قيمة لتشخيص أو تشخيص حالات المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام exosomes تجريبيا كمركبات للمركبات العلاجية 2,12. إن التطبيق المحتمل لهذه الحويصلات النانوية في العيادة يجعل طريقة العزل ذات أهمية متزايدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الغلة والنقاء والتكاثر. تم تطوير وتنفيذ تقنيات مختلفة لعزل الإكسوسومات. بشكل عام ، يمكن عزل الإكسوسومات من وسائط زراعة الخلايا المكيفة أو سوائل الجسم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتقاط المناعة (باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا). كل نهج له مزايا وعيوب فريدة تمت مناقشتها سابقا1،2،13،14.
يركز البروتوكول المبين على 1) عزل وزراعة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة و 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات التي تطلقها هذه الخلايا في وسط الثقافة. لا يوجد حاليا بروتوكول راسخ لعزل الإكسوسومات من الخلايا الليفية الأولية للدراسات الوظيفية. لا تفرز الخلايا الليفية الأولية كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مما يجعل عملية العزل والتنقية صعبة. يصف هذا البروتوكول تنقية كميات كبيرة من الإكسوسومات النقية من أحجام كبيرة من الثقافة مع الحفاظ على سلامتها المورفولوجية ونشاطها الوظيفي. تم استخدام الإكسوسومات المنقاة التي تم الحصول عليها من وسط مكيف بنجاح في تجارب الامتصاص في المختبر للحث على مسارات إشارات محددة في الخلايا المتلقية. كما تم استخدامها للتحليلات البروتينية المقارنة للشحنات الخارجية من عينات بيولوجية متعددة4.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للعزل الناجح للإكسوسومات من وسائط الاستزراع ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، في إنشاء وصيانة مزارع الخلايا الليفية الأولية للفأر من العضلات الهيكلية البالغة. يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أليساندرا دازو حاصلة على كرسي مجوهرات الأطفال (JFC) في علم الوراثة والعلاج الجيني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01GM104981 و RO1DK095169 و CA021764 ومؤسسة أسيزي في ممفيس والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
