Worm-align/Worm_CP er en simpel FIJI / CellProfiler workflow, der kan bruges til at rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og til at score hele ormen billede-baserede analyser uden behov for forudgående uddannelse trin. Vi har anvendt Worm-align/Worm_CP til kvantificering af varmechok induceret udtryk i levende dyr eller lipiddråber i faste prøver.
Et problem, der ofte opstår, når de henter billeddata fra fast eller bedøvet C. elegans er, at orme krydser og klynger med deres naboer. Dette problem forværres med stigende tæthed af orme og skaber udfordringer for billedbehandling og kvantificering. Vi udviklede en FIJI-baseret arbejdsgang, Worm-align, der kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af brugeropdelede, rettede og justerede orme fra rå billeddata af C. elegans. Worm-align er en enkel og brugervenlig arbejdsproces, der ikke kræver forudgående uddannelse af hverken brugeren eller analysealgoritmen. Montager genereret med Worm-align kan støtte den visuelle inspektion af orme, deres klassificering og repræsentation. Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Som et praktisk eksempel har vi brugt rørledningen på to datasæt: det første datasæt er billeder af varmechok reporter orme, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af promotoren for et varmechok inducerende gen hsp-70, og det andet datasæt er billeder fra faste orme, farves for fedt-butikker med en fluorescerende farvestof.
En forholdsvis enkel organisme, nematode C. elegans, er en yderst nyttig model system til at studere sygdomme hos mennesker. Omkring 38% af generne i C. elegans genomet har funktionelle modstykker hos mennesker1,2. En af de unikke egenskaber ved C. elegans er, at det er optisk gennemsigtig, så nem adgang til in vivo oplysninger om (sub) cellulære udtryk for fluorescerende journalister på tværs af væv. Dette gør C. elegans en førsteklasses model organisme for højt indhold skærme ved hjælp af billedbaserede platforme3. Men et problem, der ofte komplicerer disse undersøgelser er, at når billeddannelse tætte populationer af orme, de har tendens til at krydse og klynge, foretage sammenligninger på tværs af de enkelte orme udfordrende, uklarhed downstream billedanalyse og kvantitet.
Eksisterende løsninger, derovervinderdette problem, er typisk afhængige af optimering af dyrknings- og billeddiagnostisk protokol,f.eks. Andre har anvendt machine-learning algoritmer giver mulighed for anerkendelse af enkelte orme, selv i en klumpet befolkning. Et glimrende eksempel på sidstnævnte er WormToolbox, som er en modulær udvidelse af open source-billedanalyse platform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyder en løsning med høj overførselshastighed og højt indhold til analyse af C. elegans, og det er klart, at det er en god fordel, at den er inkluderet i CellProfiler, da yderligere analysemoduler nemt kan medtages. Selvom WormToolbox leveres med en færdig uddannet model (DefaultWormModel.xml), er omskoling af maskinlæringsalgoritmen normalt påkrævet for hvert nyt program. Online tutorials om hvordan du gør dette er tilgængelige på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). På trods af dette, installere og bruge WormToolbox kræver en betydelig tidsinvestering for nybegyndere.
Her beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv og tidseffektiv protokol til kultur og billedpopulationer af C. elegans. For at gøre det muligt at vurdere de enkelte orme i de erhvervede billeder har vi udviklet en simpel open source FIJI-baseret arbejdsgang, kaldet Worm-align. Worm-align kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af rettede og justerede orme. For det første skal brugeren manuelt vælge individuelle orme til analyse ved at trække en linje fra hovedet til halen. Worm-align bruger denne markering til at beskære markerede orme fra oversigtsbilledet og generere en montage, hvor udvalgte orme rettes og justeres for at lette visuel sammenligning og præsentation.
Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Vi har brugt Worm_CP rørledningen til at kvantificere varmechokrespons, en godt bevaret beskyttende mekanisme, der omfolderer proteiner, der er fejlfoldet på grund af stressfaktorer såsom høj temperatur8. Konkret har vi anvendt rørledningen til orme bærer en integreret multi-kopi transgene, hvor initiativtageren til en varmechok inducerende gen, hsp-70 (C12C8.1), drev grøn fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brugt Worm_CP rørledningen på faste dyr, der er blevet mærket med en fluorescerende farvestof, der visualiserer lipid dråber (LDs), de vigtigste fedt opbevaring organelle i C. elegans10. Selvom denne arbejdsproces ikke har det gennemløb, der tilbydes af WormToolBox, er det et brugervenligt og enkelt alternativ til visuel præsentation og analyse af billedbaserede C. elegans eksperimenter.
Worm-align er en FIJI-baseret billedbehandlingspipeline, der let genererer montager af brugervalgte orme, hvor orme rettes og justeres for at hjælpe med visuel sammenligning, klassificering og repræsentation. Selv om denne funktion er også tilbydes af nogle eksisterende værktøjer, især WormToolbox modul i CellProfiler7, Worm-align kræver forholdsvis lidt forudgående billedanalyse erfaring: Brugere behøver kun at spore de orme, de gerne vil vælge til montage (og analyse). Selv om det er nemt at spore ormene på de rå billeddata , især når en berøringsskærmscomputer eller -tablet er tilgængelig, er det altafgørende, at linjer tegnes korrekt langs ormenes længdeakse. Ufuldstændige linjer, der kun følger en del af ormen, vil resultere i delvise orme i montagen (dvs. orme manglende hoveder af hale ender) og delvis segmentering masker under CellProfiler analyse. Hvis linjer fra to individuelle orme krydser, behandles ormene heller ikke korrekt i ormenjusteringsmontagen samt til fluorescens kvantificering. Til kvalitetskontrol gemmes et overlejringsbillede af linjevalgene på det oprindelige billede i datamappen sammen med en QC-tabel. Fra disse kan problematiske linjer, der fører til forkert segmenterede orme, let identificeres og udelukkes fra montage og/eller efterfølgende analyse.
Selv om den direkte input fra eksperimentatoren i udvælgelsen af orme måske synes lidt tidskrævende, det præsenterer en klar fordel af arbejdsgangen i forhold til andre i eksperimenter, hvor orme fra forskellige udviklingsstadier er til stede i det samme billede: Orme kan vælges i løbet af “sporing trin”, ved at skitsere kun de orme, der er i den rigtige udviklingsfase. Alternativt kan orme filtreres ved hjælp af output fra Worm_CP baseret på enten længden af sporingslinjen eller segmentmaskens område, begge pålidelige indikatorer for ormenes længde/størrelse. Velsagtens, machine-learning algoritmer kan kæmpe for at genkende orme fra forskellige udviklingsstadier, som deres størrelse og udseende i DIC billeder er så forskellige.
Produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerede dette ved at importere Worm-align output i en simpel CellProfiler pipeline (Worm_CP), som gør det muligt at kvantificere multi-kanal fluorescens intensitet i de enkelte orme, der blev valgt, mens du kører Worm-align pipeline. Vi valgte denne tilgang på grund af cellprofiler-softwarens fleksibilitet: Det er ligetil at indarbejde yderligere moduler i rørledningen for at analysere yderligere funktioner i de enkelte orme (f.eks. måling af størrelsen af lipiddråber eller stressgranulat, kerner, mitokondrier). Desuden kan de enkelte orm masker potentielt bruges til at træne en ny model for WormToolbox7.
De vigtigste fordele ved denne metode er, at det er hurtigt og kræver en simpel orm montering set-up. Denne metode er hurtigere, da det ikke kræver at bruge tid på at lære software drift eller kører uddannelse sæt gennem en maskinealgoritme 7. Desuden virker denne metode med enten levende eller faste orme simpelthen monteret på regelmæssige agarose puder. Der er ingen grund til at anvende komplekse mikrofluidiske kamre, som er udviklet i andremetoder 5,6.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Christian Lanctôt på BIOCEV (Prag, Tjekkiet) for at lære os munden mikropipette teknik til at montere faste orme og Dr. Fatima Santos og Dr. Debbie Drage for at dele sikkerhed setup på munden mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for at have redigeret manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC understøttes af ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |