质谱分析，用于识别 EYFP 标记 CENP-A （EYFP-CENP-A） 的泛化
Summary
CENP-A泛化是CENP-A在中心区沉积的重要要求，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP标记CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛化。
Abstract
研究基诺胆和中中心体的结构与动力学对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。染色体的位置和功能如何确定中心（即中心体特性）并参与准确的染色体分离是一个根本问题。CENP-A被建议为中心鉴定的非DNA指标（表观遗传标记），CENP-A泛化是中心体沉积所需的，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。
在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明，由于CENP-A K124R突变蛋白中的EYFP标记，在不同的LyFP标记诱导了不同莱氨酸的泛基化。通过质谱分析，成功识别了EYFP-CENP-A K124R中的莱辛306（K306）泛化，与CENP-A中的莱氨酸56（K56）相对应。使用GFP/EYFP或标记高分子量蛋白质作为分析蛋白质功能的工具时讨论了一个警告。目前还讨论了对泛基带的检测、对位点特异性泛基化的识别以及活细胞或整个细胞周期中特定单细胞泛化的可视化的技术限制。
本文介绍的质谱分析方法可应用于具有不同标签的人类CENP-A蛋白和其他中分蛋白。这些组合方法由几种分析/分析组成，可以推荐给有兴趣识别泛基化功能作用的研究人员。
Introduction
在大多数真核生物中，主轴微管必须附着在每条染色体的单个区域上，称为中心。基内托多尔是位于百分中心附近的蛋白质复合体。研究中胸和基内托多尔蛋白运动的时间以及基内托丘尔和中心体的结构对于了解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。关键问题是如何确定中心仪的染色体位置和功能（即中心身份），以及它们如何参与准确的染色体分离。在大多数物种中，含有一种称为CENP-A的特定组蛋白的特殊核细胞的存在定义了中位认同。因此，建议CENP-A是中心标识的非DNA指标（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何定义人类中中心身份的机制非常重要。
Holliday结识别蛋白（HJURP）是CENP-A特异性伴郎，它沉积在中中心核,体,1、2、3中。3我们之前曾报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连结对于Lysine124（K124）和中圆素定位4的CENP-A泛基酶是必需的。此外，我们的结果表明，新合成的CENP-A的中程招募需要预先存在的泛基化CENP-A5。因此，提供了一个模型，表明CENP-A泛基化是通过细胞分裂之间的二化遗传的。
与我们的发现和余等人的调查结果相反，最近发表了关于CENP-A及其中心定位的负面结果。文章称，CENP-A对莱辛124（K124）的修改对于人类中心体的建立、维持和长期功能是可有的，基于其负面结果表明，K124R的突变不影响CENP-A中心体定位，两者细胞的生存能力6。然而，在他们的结果和结论中有足够的空间进行辩论，我们已经在他们以前的出版物7中描述了什么问题。需要注意的是，它们将蛋白质与CENP-A融合在一起，其分子量比内源CENP-A大得多：例如，它们将+30 kDa增强性黄色荧光蛋白（EYFP）融合到+16kDa CENP-A，并分析了RPE-1 CENP-A K124R融合蛋白中的RPE-1CENP-A-F-F淘汰系统。根据结构预测4，K124泛素预计不会直接与HJURP结合，但是，单泛素的添加预计将对CENP-A的蛋白质构象产生影响。CENP-A构象的蛋白质可以通过大型融合蛋白的存在来改变，这种构象变化可能掩盖由泛基化损失引起的结构变化。我们建议，大尺寸蛋白质的融合在EYFP-CENP-A K124R突变体中诱导K124以外的Lysine泛基化，而另一个站点的这种泛基化抑制/掩盖原始的K124R单突变表型。CENP-A K124R突变蛋白中具有大标签蛋白（EYFP）的不同莱辛发生泛基化的证据，在我们的上一份出版物8中报道。研究发现，EYFP标记诱导EYFP-CENP-A K124R的另一个莱辛站点的泛化，EYFP-CENP-A K124R突变体与HJURP结合。因此，在另一个站点的这种泛化抑制/掩盖了原始的K124R单突变体，EYFP-CENP-A WT和K124R突变体都显示出百分位定位（我们使用并比较了pBabe-EYFP-CENP-A WT和K124R突变体，以及pBabe-FPEY控制）。结果表明，标记或未标记的CENP-A K124R突变体是致命的，但可以通过单比素融合来拯救，这表明CENP-A泛化对于细胞的生存能力是必不可少的。
近年来，许多研究已经开发出不同的分析方法，以识别CENP-A蛋白和其他中端细胞-基内托托蛋白的翻译后修饰（PTMs），包括体内和体外,9、10、11。,1011与组蛋白的PTM类似，作为调节染色质功能的主要机制，中分色染色质成分的PTM也参与调节中分素整体结构和功能的基本机制。大多数CENP-A PTM位点特定于CENP-A含核糖体，尽管其中一些在组蛋白H3中保存，这表明这些残留物的修饰有助于中分中心特异性功能。CENP-A的PTM包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛化，9日曾报道过，这表明CENP-A在其氨基元和C-术语组蛋白折叠域上受到各种PTM及其组合阵列的影响。CENP-A 在多个函数中修改的重要性被包括我们在内的许多团体所揭示。这些功能涉及CENP-A在中心沉积，蛋白质稳定性，和CCAN（构成中心相关网络）的招募9。然而，CENP-A PPTM 的有限研究和发现是预先形成，其中比较与直接或间接调节其功能的规范组体之一进行比较。侧重于确定这些 CENP-A PPTM 方法的技术报告也有限。
由于CENP-A泛化是CENP-A在中心12的沉积所需要，通过细胞分裂5之间的二化遗传，对细胞活力8不可或缺，因此，识别CENP-A泛化的方法在未来对于研究中心的功能活性、定位和结构至关重要。因此，在这里我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的泛基化。提出了其他控制测定和分析（免疫荧光分析、菌落生长测定和体内泛化分析）的规程，以恰当地讨论主要质谱分析的结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了质谱分析的方法，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的泛基化。在我们的结果中，我们通过质谱分析成功地确定了EYFP-CENP-A K124R中莱辛306（K306）的泛化，与CENP-A中的Lysine 56（K56）相对应。此处描述的质谱分析是一种模拟方法，因为我们之前识别的是 CENP-A WT-Flag12的 Lysine 124 （K124） 泛化位点?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢南京大学动物模型研究中心的李超军进行质谱分析。我们感谢延米尼·达拉尔、福田康夫和南京大学动物模型研究中心和格力儿童癌症研究所的现任研究人员，感谢他们的有益讨论、实验指导和试剂。我们感谢唐·克利夫兰、丹尼尔·法奇内蒂、扬米尼·达拉尔、明·布伊、古斯塔沃·莱昂、约翰·汤普森、劳伦斯·基尔希纳、阿姆鲁塔·阿什特卡尔、本·布莱克、格伦尼斯·洛格斯顿、肯吉·塔戈和黎明·钱德勒的慷慨捐赠。Y.N.由江苏省”双一级”建设基金、江苏省自然科学基金（SBK201021248）、江苏省第十六届六大人才高峰基金（TD-SWYY-001）、江苏省”外国专家百人计划”基金（SBK201010048）和中国国家自然科学基金（31970665）资助。这项研究得到了NCI赠款R21 CA205659的部分支持。
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
