Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren
Summary
CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.
Abstract
Het bestuderen van de structuur en de dynamiek van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosomale instabiliteit (CIN) en kankerprogressie. Hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie is een fundamentele vraag. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren, wat suggereert dat alomtegenwoordigheid bij een andere lysine wordt veroorzaakt door de EYFP-tagging in het CENP-A K124R gemuteerd eiwit. Lysine 306 (K306) alomtegenwoordigheid in EYFP-CENP-A K124R werd met succes geïdentificeerd, wat overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrie analyse. Een voorbehoud wordt besproken in het gebruik van GFP /EYFP of het taggen van eiwit met een hoog moleculair gewicht als hulpmiddel om de functie van een eiwit te analyseren. Huidige technische limiet wordt ook besproken voor de detectie van alomquitylated banden, identificatie van site-specifieke alomtegenwoordigheid(en), en visualisatie van alomtegenwoordigheid in levende cellen of een specifieke eencellige cel tijdens de hele celcyclus.
De methode van massaspectrometrie analyse hier gepresenteerd kan worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore eiwitten. Deze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests / analyses kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid.
Introduction
In de meeste eukaryoten moeten spindelmicrotubuli zich hechten aan één enkel gebied van elk chromosoom, centromere genoemd. De kinetochore is een complex van eiwitten die zich op de centromere bevinden. Het bestuderen van de timing van centromere en kinetochore eiwit bewegingen en de structuur van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosoom instabiliteit (CIN) en kanker progressie. De belangrijkste vragen zijn hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en hoe ze deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie. In de meeste soorten, de aanwezigheid van een speciaal nucleosoom met een specifieke histone-achtige eiwit genaamd CENP-A definieert de centromere identiteit. Daarom wordt voorgesteld dat CENP-A de niet-DNA-indicator (epigenetisch merk) van centromere identiteit is. Het is belangrijk om het mechanisme op te helderen van hoe CENP-A de centromere identiteit bij mensen definieert.
De Holliday junction recognition protein (HJURP) is de CENP-A-specifieke chaperon die CENP-A in centromerische nucleosomen1,2,3deponeert . We have previously reported that the CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase is required for CENP-A ubiquitylation on lysine 124 (K124) and centromere localization4. Ook onze resultaten toonden aan dat de centromere werving van nieuw gesynthetiseerde CENP-A vereist reeds bestaande ubiquitylated CENP-A5. Thus, a model was provided suggesting that CENP-A ubiquitylation is inherited through dimerization between cell divisions.
In tegenstelling tot onze bevindingen en die van Yu et al., werden de negatieve resultaten betreffende CENP-A en zijn centromeric lokalisatie onlangs gepubliceerd6. Het artikel beweerde dat CENP-A wijzigingen op lysine 124 (K124) zijn onmisbaar voor de oprichting, onderhoud, en de functie op lange termijn van de menselijke centromeres, op basis van hun negatieve resultaten waaruit blijkt dat de mutatie van K124R niet van invloed CENP-A centromere lokalisatie noch cel levensvatbaarheid6. Er is echter voldoende ruimte voor discussie in hun resultaten en conclusies, en we hebben al beschreven welk probleem er zou kunnen zijn in hun vorige publicatie7. Er moet op worden gelet dat ze eiwitten hebben versmolten met CENP-A, die veel grotere moleculaire gewichten hebben dan de grootte van endogene CENP-A: bijvoorbeeld, ze gesmolten ~ 30 kDa verbeterde gele fluorescente eiwitten (EYFP) tot ~ 16 kDa CENP-A en analyseerde EYFP-CENP-A K124R fusie eiwit in hun RPE-1 CENP-A-/F knock-out systeem. K124 ubiquitine zal naar verwachting niet rechtstreeks binden aan HJURP op basis van structurele voorspellingen4,maar de toevoeging van mono-ubiquitine zal naar verwachting een impact hebben op de eiwitcontenschap van CENP-A. Het eiwit van CENP-A-conformatie kan worden veranderd door de aanwezigheid van een groot fusie-eiwit, en deze conformatieverandering kan de structurele veranderingen maskeren die worden veroorzaakt door het verlies van alomtegenwoordigheid. Wij stellen voor dat de fusie van groot-en klein-grote eiwit alome alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt / maskeert de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype. Bewijs dat alomtegenwoordigheid optreedt bij verschillende lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit met een large tag eiwit (EYFP) werd gemeld in onze vorige publicatie8. Er werd vastgesteld dat EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert van een andere lysinesite van EYFP-CENP-A K124R en dat EYFP-CENP-A K124R mutant bindt aan HJURP. Als gevolg hiervan remt/maskeert deze alomtegenwoordigheid op een andere locatie het oorspronkelijke K124R enkel mutantene fenotype, en zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden centromere lokalisatie (we gebruikten en vergeleken pBabe-EYFP-CENP-A WT en K124R mutant, samen met pBabe-EYFP control.). The results demonstrated that Flag-tagged or untagged CENP-A K124R mutants are lethal but can be rescued by a monoubiquitin fusion, suggesting that CENP-A ubiquitylation is indispensable to cell viability.
In de afgelopen jaren hebben veel studies verschillende tests ontwikkeld om posttranslationele modificaties (PTMs) van CENP-A-eiwit en andere centromere-kinetochore-eiwitten te identificeren, zowel in vivo als in vitro9,10,11. Analoog aan de PTMs van histoneiwitten die een belangrijk mechanisme zijn dat de functie van chromatine regelt, zijn PTMs van centromerische chromatinecomponenten ook betrokken bij een essentieel mechanisme om de algehele structuur en functie van centromeres te reguleren. De meeste CENP-A PTM-sites zijn specifiek voor CENP-A-bevattende nucleosomen, hoewel een paar daarvan in histone H3 worden bewaard, wat suggereert dat wijziging van deze residuen bijdraagt aan de centromere-specifieke functie. PTMs van CENP-A met inbegrip van fosforylatie, acetylatie, methylatie, en alomtegenwoordigheid werden eerder gemeld9, wat suggereert dat CENP-A wordt onderworpen aan een verscheidenheid van PTM’s en hun combinatorische arrays op zijn amino terminus en C-terminus histone-fold domein. Het belang van CENP-A wijzigingen in meerdere functies werd onthuld door vele groepen, waaronder de onze. Deze functies omvatten CENP-A depositie bij centromeres, eiwitstabiliteit en rekrutering van het CCAN (constitutief centromere-geassocieerd netwerk)9. Beperkte studies en bevindingen van CENP-A PTM’s zijn echter voorgevormd wanneer vergelijkingen worden gemaakt met een van canonieke histonen die hun functie direct of indirect reguleren. Technische rapporten die zich richten op de methodologie om deze CENP-A PTMs te identificeren zijn ook beperkt.
Because CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere12, inherited through dimerization between cell division5, and indispensable to cell viability8, the method to identify CENP-A ubiquitylation would be essential in future to study the functional activity, positioning, and structure of the centromere. Daarom beschrijven we hier massaspectrometrie-analyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R-mutant te identificeren, wat suggereert dat de EYFP-tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in het CENP-A K124R gemuteerde eiwit8. Protocollen van andere controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) worden ook gepresenteerd om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven we methoden van massaspectrometrie analyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren suggereert dat de EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit8. In onze resultaten hebben we met succes alomtegenwoordigheid geïdentificeerd op lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, die overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrieanalyse. De hier beschreven massaspectrometrieanalyse …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chao-Jun Li van het Model Animal Research Center, Nanjing University voor de analyse van massaspectrometrie. Wij danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, en de huidige onderzoekers van het Model Animal Research Center, Nanjing University en Greehey Children’s Cancer Research Institute voor hun nuttige discussie, experimentele begeleiding en reagentia. Wij danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago en Dawn S. Chandler voor hun gulle giften van reagentia. Y.N. werd ondersteund door de provincie Jiangsu ”Double-First-Class” Bouwfonds, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province “Foreign Expert Hundred Talents Program” Fund (SBK2019010048) en National Natural Science Foundation in China (31970665). Deze studie werd mede ondersteund door NCI grant R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
