Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos
Summary
En este protocolo, las nanopartículas de oro modificadas con doxorrubicina AS1411-g-PEI-g-PEG se sintetizan a través de reacciones de amida de tres pasos. Luego, la doxorrubicina se carga y se administra a las células cancerosas diana para el tratamiento del cáncer.
Abstract
Debido a la resistencia a los medicamentos y a la toxicidad en células sanas, el uso del doxorubicin (DOX) se ha limitado en terapia clínica del cáncer. Este protocolo describe el diseño de poli(etilenimina) injertado con polietilenglicol (PEI-g-PEG) copolímero funcionalizado nanopartículas de oro (AuNPs) con aptámero cargado (AS1411) y DOX a través de reacciones de amida. AS1411 se une específicamente con los receptores de nucleolina dirigidos en las células cancerosas para que DOX se dirija a las células cancerosas en lugar de las células sanas. Primero, la CLAVIJA es carboxylated, después injertada a PEI ramificado para obtener un copolímero de PEI-g-PEG, que es confirmado por el análisis de 1H NMR. A continuación, se sintetizan nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs), y DOX y AS1411 se unen covalentemente a AuNPs gradualmente a través de reacciones de amida. El diámetro del AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparado es de ~39,9 nm, con un potencial zeta de -29,3 mV, lo que indica que las nanopartículas son estables en agua y medio celular. Los ensayos de citotoxicidad celular muestran que los AuNPs cargados de DOX de nuevo diseño son capaces de matar las células cancerosas (A549). Esta síntesis demuestra la delicada disposición de los copolímeros PEI-g-PEG, aptámeros y DOX en AuNPs que se logran mediante reacciones secuenciales de amida. Tales AuNPs funcionalizados aptamer-PEI-g-PEG proporcionan una plataforma prometedora para la entrega de la droga apuntada en terapia del cáncer.
Introduction
Siendo el principal problema de salud pública en todo el mundo, el cáncer se caracteriza ampliamente por tener una baja tasa de curación, alta tasa de recurrencia y alta tasa de mortalidad1,2. Los métodos anticancerígenos convencionales actuales incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia3,entre los cuales la quimioterapia es el tratamiento primario para los pacientes con cáncer en la clínica4. Los fármacos contra el cáncer utilizados clínicamente incluyen principalmente paclitaxel (PTX)5 y doxorrubicina (DOX)6,7. Dox, un fármaco antineoplásico, se ha aplicado ampliamente en la quimioterapia clínica, debido a las ventajas de la citotoxicidad del cáncer y la inhibición de la proliferación de células cancerosas8,9. Sin embargo, el DOX causa cardiotoxicidad10,11,y la corta vida media del DOX restringe su aplicación en la clínica12. Por lo tanto, los portadores degradables de la droga son necesarios cargar DOX y subquently liberar de una manera controlada a un área apuntada.
Las nanopartículas se han utilizado ampliamente en sistemas de administración de fármacos dirigidos y tienen varias ventajas en el tratamiento del cáncer (es decir, una relación superficie-volumen considerable, tamaño pequeño, capacidad para encapsular varios fármacos y química de superficie sintonizable, etc.) 13,14,15. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) se han utilizado ampliamente en aplicaciones biológicas y biomédicas, como la terapia fototérmica contra el cáncer16,17. Las propiedades únicas de los AuNPs, como la síntesis fácil y la funcionalización general de la superficie, tienen excelentes perspectivas en el campo clínico de la terapia contra el cáncer18. Además, los AuNPs se han utilizado para identificar estrategias de administración de fármacos, diagnosticar tumores y superar la resistencia en muchos estudios19,20.
No obstante, los AuNPs necesitan ser adaptados más a fondo para superar resistencia a los medicamentos vía el alto lanzamiento local en las lesiones del tumor con la permeación y la retención aumentadas (EPR), tales como las propiedades de la blanco y de la accesibilidad. Los AuNPs funcionalizados con polímeros han exhibido ventajas únicas, como la mejora de la solubilidad en agua de los fármacos hidrofóbicos contra el cáncer y el tiempo de circulación prolongado21,22. Se han utilizado varios polímeros biocompatibles para recubrimientos de AuNP, como el polietilenglicol (PEG), la polietilenimina (PEI), el ácido hialurónico, la heparina y la goma xantana. Entonces la estabilidad, así como la carga útil, de AuNPs se mejora bien23. Específicamente, pei es un polímero altamente ramificado que se compone de muchas unidades de repetición de aminas primarias, secundarias y terciarias24. PEI tiene una excelente solubilidad, baja viscosidad y un alto grado de funcionalidad, que es adecuado para el recubrimiento en AuNPs.
Por otro lado, los fármacos anticancerígenos deben ser entregados a las células cancerosas directamente con una mejor eficiencia de carga, y con menor toxicidad para el tratamiento de tumores metastásicos primarios y avanzados25. Los ligandos dirigidos tienen un gran potencial para los sistemas de administración dirigidos a fármacos contra el cáncer26. Su selectividad para la unión a moléculas diana confiere especificidad a los fármacos contra el cáncer y aumenta el enriquecimiento de fármacos en tejidos enfermos27. Más ligandos incluyen anticuerpos, polipéptidos y moléculas pequeñas. En comparación con otros ligandos, los aptámeros de ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro y son fáciles de modificar. AS1411 es un oligonucleótido fosfodiester de 26 pb no modificado que forma una estructura dimérica estable de G-tetrámero para unirse específicamente a un receptor de proteína nuclear objetivo sobreexpresado en las células cancerosas28,29,30. AS1411 inhibe la proliferación de muchas células cancerosas pero no afecta el crecimiento de células sanas31,32. Como resultado, AS1411 se ha utilizado para fabricar un sistema ideal de administración de fármacos dirigidos.
En este estudio, un copolímero PEI-g-PEG se sintetiza a través de una reacción de amida, a continuación, se fabrican nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Además, DOX y AS1411 están vinculados secuencialmente a la PEG@AuNPs PEI-g preparada, como se muestra en la Figura 1. Este protocolo detallado está destinado a ayudar a los investigadores a evitar muchos de los escollos comunes asociados con la fabricación de nuevos PEI-g-PEG@AuNPs cargados con DOX y AS1411.
Protocol
Representative Results
Discussion
El espectro de RMN 1H(Figura 2)confirma la síntesis exitosa del copolímero CT-PEG y del copolímero PEI-g-PEG. Los pesos moleculares de PEG y PEI fueron de 1.000 y 1.200, respectivamente. Además, se utilizó el sistema catalítico EDC/NHS para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG mediante reacciones de amida. Cabe señalar que si los pesos moleculares de PEG y PEI cambiaron para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG, entonces el tiempo de reacción y el sistema catalítico deben s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31700840); el Proyecto clave de investigación científica de la provincia de Henan (18B430013, 18A150049). Esta investigación fue apoyada por el Nanhu Scholars Program for Young Scholars de XYNU. A los autores les gustaría agradecer al estudiante de licenciatura Zebo Qu de la Facultad de Ciencias de la Vida en XYNU por sus útiles trabajos. A los autores les gustaría agradecer al Centro de Análisis y Pruebas de XYNU por el uso de sus equipos.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
