Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining
Summary
Ce protocole décrit un système de culture dynamique pour produire des agrégats de taille contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines et stimuler davantage la différenciation des organoïdes cérébellaires dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation à l’aide d’un bioréacteur à usage unique.
Abstract
Le cervelet joue un rôle critique dans le maintien de l’équilibre et de la coordination motrice, et un défaut fonctionnel dans différents neurones cérébellaires peut déclencher un dysfonctionnement cérébelleux. La plupart des connaissances actuelles sur les phénotypes neuronaux liés à la maladie sont basées sur des tissus post mortem, ce qui rend difficile la compréhension de la progression et du développement de la maladie. Des modèles animaux et des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisés comme modèles pour les troubles neurodégénératifs. Cependant, ils ne récapitulent pas complètement la maladie humaine. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation des maladies et fournissent une source précieuse pour les approches régénératrices. Ces dernières années, la génération d’organoïdes cérébraux à partir d’iPSC dérivés du patient a amélioré les perspectives de modélisation des maladies neurodégénératives. Cependant, les protocoles qui produisent un grand nombre d’organoïdes et un rendement élevé de neurones matures dans les systèmes de culture 3D font défaut. Le protocole présenté est une nouvelle approche pour la production reproductible et évolutive d’organoïdes humains dérivés de l’iPSC dans des conditions chimiquement définies à l’aide de bioréacteurs évolutifs à usage unique, dans lesquels les organoïdes acquièrent l’identité cétebelaire. Les organoïdes générés sont caractérisés par l’expression de marqueurs spécifiques à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. L’analyse de groupes spécifiques de protéines permet la détection de différentes populations de cellules cérebelaires, dont la localisation est importante pour l’évaluation de la structure organoïde. La cryosection organoïde et l’immunostaining supplémentaire des tranches organoïdes sont utilisés pour évaluer la présence de populations spécifiques de cellules cérebelaires et leur organisation spatiale.
Introduction
L’émergence de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) représente un excellent outil pour la médecine régénérative et la modélisation des maladies, parce que ces cellules peuvent être différenciées dans la plupart des lignées cellulaires du corps humain1,2. Depuis leur découverte, la différenciation psc utilisant diverses approches a été rapportée pour modéliser différentes maladies, y compris les désordres neurodégénératifs3,4,5,6.
Récemment, il y a eu des rapports des cultures 3D dérivées des PSC ressemblant aux structures cérébrales humaines ; ceux-ci sont appelés organoïdes du cerveau3,7,8. La génération de ces structures à partir de CSP sains et spécifiques aux patients offre une occasion précieuse de modéliser le développement humain et les troubles neurodéveloppementaux. Cependant, les méthodes utilisées pour générer ces structures cérébrales bien organisées sont difficiles à appliquer pour leur production à grande échelle. Pour produire des structures suffisamment grandes pour récapituler la morphogenèse tissulaire sans nécrose à l’intérieur des organoïdes, les protocoles s’appuient sur l’engagement neuronal initial dans des conditions statiques, suivi de l’encapsulation dans les hydrogels et de la culture subséquente dans les systèmes dynamiques3. Toutefois, de telles approches peuvent limiter l’augmentation potentielle de la production d’organoïdes. Même si des efforts ont été faits pour diriger la différenciation psc à des régions spécifiques du système nerveux central, y compris cortical, striatal, midbrain, et les neurones de la moelle épinière9,10,11,12, la génération de régions spécifiques du cerveau dans des conditions dynamiques est toujours un défi. En particulier, la génération de neurones cérebelaires matures dans les structures 3D n’a pas encore été décrite. Muguruma et coll. ont été les pionniers de la génération de conditions culturelles qui récapitulent le développement cérébellaire précoce13 et ont récemment signalé un protocole qui permet aux cellules souches embryonnaires humaines de générer une structure polarisée rappelant le cervelet du premier trimestre7. Cependant, la maturation des neurones cérébellaires dans les études rapportées nécessite la dissociation des organoïdes, le tri des progéniteurs cérébellaires, et la coculture avec des cellules d’alimentation dans un système de culture monocouche7,14,15,16. Par conséquent, la génération reproductible des organoïdes cérébellaires désirés pour la modélisation de la maladie dans des conditions définies est toujours un défi associé à la culture et à la variabilité des sources d’alimentation.
Ce protocole présente des conditions de culture optimales pour l’expansion 3D et une différenciation efficace des CSP humains en neurones cérébellaires à l’aide de bioréacteurs à roue verticale à usage unique (voir tableau des matériaux pour les spécifications), ci-après appelé bioréacteurs. Les bioréacteurs sont équipés d’un grand rotor vertical, qui, en combinaison avec un fond en forme de U, fournissent une distribution de cisaillement plus homogène à l’intérieur du récipient, permettant un mélange doux et uniforme et la suspension des particules avec des vitesses d’agitation réduites17. Avec ce système, des agrégats cellulaires contrôlés par la forme et la taille peuvent être obtenus, ce qui est important pour une différenciation plus homogène et plus efficace. En outre, un plus grand nombre d’organoïdes dérivés de l’iPSC peuvent être générés d’une manière moins laborieuse.
La principale caractéristique des organoïdes, qui sont des structures multicellulaires 3D habituellement formées à partir de cellules souches, est l’auto-organisation de différents types de cellules qui forme des formes spécifiques comme celles observées dans la morphogenèse humaine18,19,20. Par conséquent, la morphologie organoïde est un critère important à évaluer au cours du processus de différenciation. La cryosection des organoïdes et l’immunostaining supplémentaire des tranches d’organoïdes avec un ensemble spécifique d’anticorps permettent la visualisation spatiale des marqueurs moléculaires pour analyser la prolifération cellulaire, la différenciation, l’identité de la population cellulaire et l’apoptose. Avec ce protocole, par cryosections organoïdes immunostaining, un engagement neuronal efficace initial est observé par le7ème jour de différenciation. Au cours de la différenciation, plusieurs populations cellulaires avec l’identité cérebelaire sont observées. Après 35 jours dans ce système dynamique, le neuroépithélium cérébellaire s’organise le long d’un axe apicobasal, avec une couche apicale de progéniteurs proliférants et de neurones postmitotiques basally situés. Au cours du processus de maturation, à partir des jours 35 à 90 de différenciation, des types distincts de neurones cérébellaires peuvent être vus, y compris les cellules Purkinje (Calbindin+), les cellules de granule (PAX6+/MAP2+), les cellules Golgi (Neurogranin+), les cellules de brosse unipolaires (TBR2+), et les neurones profonds de projection de noyaux cérébraux (TBR1+). En outre, une quantité non significative de mort cellulaire est observée dans les organoïdes cérébellaires générés après 90 jours dans la culture.
Dans ce système, les organoïdes humains dérivés de l’iPSC mûrissent en différents neurones cérébellaires et survivent jusqu’à 3 mois sans avoir besoin de dissociation et de coculture de mangeoire, fournissant une source de neurones cérebelaires humains pour la modélisation des maladies.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nécessité d’un grand nombre de cellules ainsi que de conditions de culture définies pour générer des types de cellules spécifiques pour le dépistage des médicaments et les applications de médecine régénérative a été le moteur du développement de systèmes de culture évolutive. Ces dernières années, plusieurs groupes ont signalé la génération évolutive de progéniteurs neuronaux et de neurones fonctionnels32,33,<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 par l’intermédiaire de Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projet N. 007317, PD/BD/105773/2014 à T.P.S et PD/BD/128376/2017 à D.E.S.N.), projets cofinancés par FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) et FCT par le biais de la subvention PAC-PRECIS LISBOA-01-0145-FEDER-016394 et CEREBEX Génération d’Organoïdes cérébellaires pour la subvention de recherche sur l’ataxie LISBOA-0145-FEDER-029298. Le financement a également été reçu du Programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne, dans le cadre de l’Accord de subvention 739572— The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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