Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining
Summary
Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.
Abstract
O cerebelo desempenha um papel crítico na manutenção do equilíbrio e coordenação motora, e um defeito funcional em diferentes neurônios cerebelares pode desencadear disfunção cerebelar. A maior parte do conhecimento atual sobre fenótipos neuronais relacionados à doença é baseado em tecidos pós-morte, o que dificulta a compreensão da progressão e desenvolvimento da doença. Modelos animais e linhas celulares imortalizadas também têm sido usados como modelos para distúrbios neurodegenerativos. No entanto, eles não recapitulam totalmente a doença humana. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) têm grande potencial para modelagem de doenças e fornecem uma fonte valiosa para abordagens regenerativas. Nos últimos anos, a geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs derivados do paciente melhorou as perspectivas de modelagem de doenças neurodegenerativas. No entanto, faltam protocolos que produzam um grande número de organoides e um alto rendimento de neurônios maduros em sistemas de cultura 3D. O protocolo apresentado é uma nova abordagem para a geração reprodutível e escalável de organoides derivados do iPSC humanos em condições quimicamente definidas usando bioreatores escaláveis de uso único, nos quais os organoides adquirem identidade cerebelar. Os organoides gerados são caracterizados pela expressão de marcadores específicos tanto no nível mRNA quanto no nível da proteína. A análise de grupos específicos de proteínas permite a detecção de diferentes populações de células cerebelares, cuja localização é importante para a avaliação da estrutura organoide. Criosectioning organoide e imunostaining de fatias organoides são usados para avaliar a presença de populações específicas de células cerebelares e sua organização espacial.
Introduction
O surgimento de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) representa uma excelente ferramenta para a medicina regenerativa e modelagem de doenças, pois essas células podem ser diferenciadas na maioria das linhagens celulares do corpo humano1,,2. Desde sua descoberta, a diferenciação do PSC utilizando diversas abordagens tem sido relatada para modelar diferentes doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recentemente, houve relatos de culturas 3D derivadas de PSCs semelhantes a estruturas cerebrais humanas; estes são chamados organoides cerebrais3,,7,,8. A geração dessas estruturas a partir de PSCs saudáveis e específicos para o paciente fornece uma oportunidade valiosa para modelar o desenvolvimento humano e distúrbios neurodesenvolvimentos. No entanto, os métodos utilizados para gerar essas estruturas cerebrais bem organizadas são difíceis de aplicar para sua produção em larga escala. Para produzir estruturas grandes o suficiente para recapitular a morfogênese tecidual sem necrose dentro dos organoides, os protocolos contam com o compromisso neural inicial em condições estáticas, seguido pelo encapsulamento em hidrogéis e cultura subsequente em sistemas dinâmicos3. No entanto, tais abordagens podem limitar a potencial escala da produção organoide. Embora tenham sido feitos esforços para direcionar a diferenciação do PSC para regiões específicas do sistema nervoso central, incluindo neurônios cortical, estriatal, midbrain e medula espinhal9,10,,11,12, a geração de regiões cerebrais específicas em condições dinâmicas ainda é um desafio. Em particular, a geração de neurônios cerebelares maduros em estruturas 3D ainda não foi descrita. Muguruma et al. foram pioneiros na geração de condições culturais que recapitulam o desenvolvimento cerebelar precoce13 e recentemente relataram um protocolo que permite que células-tronco embrionárias humanas gerem uma estrutura polarizada que lembra o cerebelo do primeiro trimestre7. No entanto, o amadurecimento dos neurônios cerebelares nos estudos relatados requer a dissociação dos organoides, a classificação de progenitores cerebelares e a cocultura com células alimentadoras em um sistema de cultura monocamada7,,14,,15,,16. Portanto, a geração reprodutível dos organoides cerebelares desejados para modelagem de doenças em condições definidas ainda é um desafio associado à cultura e à variabilidade da fonte alimentador.
Este protocolo apresenta condições ideais de cultura para expansão 3D e diferenciação eficiente de PSCs humanos em neurônios cerebelares usando bioreatores de roda vertical de uso único (ver Tabela de Materiais para especificações), a partir de agora chamados bioreatores. Os bioreatores são equipados com um grande propulsor vertical, que em combinação com um fundo em forma de U, fornecem uma distribuição mais homogênea de tesoura dentro do vaso, permitindo uma mistura suave, uniforme e suspensão de partículas com velocidades de agitação reduzidas17. Com este sistema, podem ser obtidos agregados celulares controlados por tamanho e tamanho, o que é importante para uma diferenciação mais homogênea e eficiente. Além disso, um número maior de organoides derivados do iPSC pode ser gerado de forma menos trabalhosa.
A principal característica dos organoides, que são estruturas multicelulares 3D geralmente formadas a partir de células-tronco, é a auto-organização de diferentes tipos de células que formam formas específicas como as vistas na morfogênese humana18,,19,,20. Portanto, a morfologia organoide é um critério importante a ser avaliado durante o processo de diferenciação. A crioseção de organoides e a imunostenção de fatias organoides com um conjunto específico de anticorpos permitem a visualização espacial de marcadores moleculares para analisar a proliferação celular, diferenciação, identidade populacional celular e apoptose. Com este protocolo, por meio de crioseções organoides imunossumunas, observa-se um compromisso neural inicial eficiente pelo7º dia de diferenciação. Durante a diferenciação, são observadas diversas populações celulares com identidade cerebelar. Após 35 dias neste sistema dinâmico, o neuroepithelium cerebelar organiza-se ao longo de um eixo apicobasal, com uma camada apical de progenitores proliferadores e neurônios pós-metóticos localizados basicamente. Durante o processo de maturação, dos dias 35 a 90 de diferenciação, podem ser vistos tipos distintos de neurônios cerebelares, incluindo células Purkinje (Calbindin+), células de grânulo (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de escova unipolar (TBR2+), e neurônios de projeção de núcleos cerebelares profundos (TBR1+). Além disso, uma quantidade não significativa de morte celular é observada nos organoides cerebelares gerados após 90 dias na cultura.
Neste sistema, organoides derivados do iPSC humano amadurecem em diferentes neurônios cerebelares e sobrevivem por até 3 meses sem a necessidade de dissociação e cocultura alimentador, fornecendo uma fonte de neurônios cerebelares humanos para modelagem de doenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
A necessidade de grandes números de células, bem como condições de cultura definidas para gerar tipos de células específicas para triagem de medicamentos e aplicações de medicamentos regenerativos tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas de cultura escalável. Nos últimos anos, vários grupos relataram a geração escalável de progenitores neurais e neurônios funcionais32,,33,34, proporcionando avanços signific…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 através do Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projeto Nº 007317, PD/BD/105773/2014 para T.P.S e PD/BD/128376/2017 para D.E.S.N.), projetos co-financiados pelo FEDER (POR Lisboa 2020 —Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT através da concessão PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Geração de Organoides Cerebelares para Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. O financiamento também foi recebido do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia, sob o Acordo de Subvenção nº 739572 — O Centro de Descobertas para Medicina Regenerativa e de Precisão H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologie du développement. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Biologie du développement. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
