ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。
治療用抗体による臨床効果の一つのメカニズムは、ナチュラルキラー(NK)細胞に発現したFcγRIIIa(CD16)によって駆動されるサイトカイン分泌や細胞傷害性などの免疫関連機能の促進である。これらの観察は、抗体のFc部分に見られるフコース部分の除去を含むFc受容体媒介事象を増加させる方法に焦点を当てた研究につながっている。さらに研究は、アフューコスシル化抗体を用いてADCC活性を増加させるシグナル伝達、細胞プロセス、および細胞傷害性特性の機械学的変化を解明した。さらに、他の研究は、低分子阻害剤と組み合わせてこれらの抗体の潜在的な利点を示している。これらの実験は、組み合わせの設定でアフコシル化抗体を使用することの利点の基礎となる分子および細胞メカニズムを実証した。これらの観察の多くは、ヒトNK細胞上のFcγRIIIaが治療抗体によって活性化された人工的なインビトロ活性化アッセイに基づいていた。このアッセイは、サイトカイン産生および脱顆粒化などの下流エフェクターNK細胞機能を研究する柔軟性を提供した。さらに、このアッセイは、シグナル伝達経路を問い合わせて、変調またはバイオマーカーとして使用できる分子を同定するために使用されています。最後に、他の治療分子(すなわち、小分子阻害剤)が、これらの治療と治療抗体の組み合わせに関する洞察を提供するために、現在の臨床空間に不可欠である。本稿は、この人工ヒトNK細胞活性化アッセイを行うための技術基盤を提供することを目的としている。このプロトコルは、セルの活性化に関する重要なステップと、機能的読み出しからより機械的な観測に至る潜在的なダウンストリームアプリケーションを示しています。
ここ数十年、抗体を用いた標的がん治療の開発に大きな焦点が当ててきました。トラスツズマブやリツキシマブなどの治療用抗体は、シグナル伝達分子の二量体化の防止および免疫系1,2の動員を含む複数のメカニズムを介して作用する。後者は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を介して達成され、その中で、ナチュラルキラー(NK)細胞と呼ばれるリンパ球が抗体1、2によって標的細胞に持ち込まれる。細胞を互いに近接させることにより、NK細胞が活性化され、エフェクター分子3の分泌を通して腫瘍/標的細胞をライセ化することができる。
分子レベルでは、抗体のFab部分は腫瘍細胞上に発現するその同結合抗原に結合し、そのFc部分はNK細胞上で発現したFcγRIIIaに係合して2つの細胞を1,2に結合する。FcγRIIIaの関与後、シグナル伝達経路(すなわち、MAPKおよびPI3K経路)は、細胞骨格再配列、サイトカイン産生、および細胞傷害性4、5、6、7、8、9を駆動する。従って、ADCCはNK細胞および抗体によって媒介されるFcγRiIIa駆動イベントである。
ADCCはこれらの治療抗体の作用機序であると考えられていたため、研究者は抗体を改変してADCCを増加させる方法を探った。一つの改変は、アスパラギン297に付着したオリゴ糖鎖上のフコースの除去であり、これはFcγRIIIa10、11、12に対する抗体のFc部分の結合親和性を増大させる。動物実験では、アフコシル化抗体を受け取ったマウスは、そのフコシル化された対応するマウス13で処置されたマウスと比較して腫瘍増殖が遅かった。さらに重要なことは、オジヌツズマブ(例えば、Gazyva、承認されたアフコスチル化抗体)は、慢性リンパ性白血病または濾胞性リンパ腫14と診断された患者においてリツキシマブ(例えば、リツキサン、そのフコシル化された相手)に対してより良い有効性を示した。
最近まで、アフコシル化抗体を介してADCCの増加の根底にあるメカニズムは不明であった。FcγRIIIa駆動型の抗体を開発する研究プログラムが数多く存在し、がん細胞を標的とする抗体を標的とし、これらの抗体が推進する分子および細胞の側面を調べるインビトロアッセイの開発が不可欠です。これは、バイオマーカーを発見する可能性だけでなく、作用機序の基本的な理解を提供します。このように、抗体依存性FcγRIIIA媒介機能を研究し、シグナル伝達および細胞特性8に加えて人工的な活性化アッセイを開発した。これらの研究を通じて、アフコシル化抗体の効力の増大の根底にあるメカニズムは、細胞特性および細胞傷害特性を促進するためにシグナル伝達を増強する結合性の高まりを解明した8。
臨床試験における現在の傾向は、治療分子16の組み合わせの使用である。最も一般的に変異した経路の1つはPI3K経路であり、この経路の成分を標的とする低分子阻害剤の開発に多大な努力を促している17、18、19、20である。しかし、これらの分子が治療抗体と組み合わせてどのように作用するかを、特に阻害剤が治療抗体によって駆動されるものなど、機能するためにPI3K経路を必要とする分子に影響を与える可能性のある組み合わせにおいて、比較的未知である。
この目的のために、このアフコシル化抗体研究のために用いられるインビトロアッセイは、PI3K阻害剤と治療抗体の組み合わせの研究にも用いられている。これらの研究は、PI3K抗体の治療上の阻害の分子特性をPI3K駆動事象と定義し、アフコシル化抗体がシグナル9のこの損失を相殺する方法を説明した。これらの知見は、臨床試験を設計するための潜在的なガイダンスを貸すため、関連しています。さらに、この一連の実験はまた、潜在的なバイオマーカーとして役立つ可能性のあるケモカイン/サイトカイン転写および産生を調節するPI3Kシグナル伝達経路の運動調節に関する最初の説明された観察に至った。
上記のシグナル伝達および細胞特性を定義するために用いられる人工的なin vitro活性化アッセイは、標的細胞の不在時に抗体によって媒介されるNK細胞におけるFcγRIIIa駆動事象を研究するように設計されている。システム内に標的細胞がなければ、観察されたすべてのシグナルイベントと機能は、NK細胞に直接起因する可能性があります。提示アッセイでは、抗体が精製されたNK細胞に添加され、その時点でFc部分がFcγRIIIaに結合する。これに続いて、抗ヒトκ軽鎖抗体を用いた抗体の架橋が、細胞を人工的に刺激する。抗体の架橋は、標的抗原の結合を模倣し、下流の事象を引き起こすシグナル伝達プラットフォームを生成する。刺激の長さに応じて、研究者はシグナル伝達、細胞プロセス、細胞毒性特性、およびエフェクター機能8,9を評価することができる。同様に、このアッセイは、抗体が他の分子9と結合されたときにこれらの事象を研究する際の柔軟性を提供する。
これは、作用機序の一部としてFcγRIIIaを介してNK細胞応答を引き出す治療抗体を研究するための理想的なインビトロアッセイです。このプロトコルは、このインビトロ活性化アッセイの性能を記述し、実行できるさまざまな読み出しに関する洞察を提供します。
本プロトコルは、抗体を媒介するNK細胞におけるFcγRIIIa駆動事象を研究するための方法を説明する。これらの技術は、ADCC1、2であることが示唆される治療抗体の作用の潜在的なメカニズムの評価を可能にする。具体的には、これらの方法は、ADCCを担う基礎となる分子シグナル伝達経路および細胞プロセスを研究する柔軟性を提供する。また、ケモカインやサイトカイン産生などの他のエフェクター機能の観察も可能です。さらに、これらの方法は、ADCCを調節するために標的とすることができる潜在的なバイオマーカーおよび分子の同定を可能にする。
このプロトコルの基礎は、標的細胞が存在しない場合の抗体を用いたFcγRIIIaを介したNK細胞の人工的な刺激である。抗体結合標的細胞は、典型的には、シグナル伝達および下流効果を駆動するプラットフォームを形成するためにFc受容体の架橋を促進するのに役立つ。その代わりに、このアッセイにおいて抗ヒトκ軽鎖抗体を用いて架橋を行い、NK細胞を刺激する標的細胞の必要性をバイパスする。標的細胞がなければ、精製プロセスが成功したと仮定して、結果と観察はNK細胞に直接起因することができる。
重要なことに、抗体を架橋する抗ヒトκ軽鎖抗体を用いてFcγRIIIaに対するFc部分の結合親和性を妨げない、応答10、11、12、13の強度を指示する相互作用である。実際、研究は、アフコシル化抗体がFcγRIIIa10、11、12、13に対するそれらの親和性の増加に起因するADCCを増加させることが示されている。その後の研究では、この親和性の増加は抗ヒトκ軽鎖二次抗体の代替の影響を受けず、ADCC8の増加の基礎を研究するために使用できることを示した。NK細胞が抗体の架橋を通じて刺激されることを確実にするために、2つの陰性対照が含まれるべきです:1)二次抗ヒトκ軽鎖抗体を含まない治療抗体、および2)二次抗ヒトκ軽鎖抗体のみ。どちらの場合も、シグナリングやエフェクター関数は生成されません。
この方法はまた、小分子阻害剤に対する治療抗体の効果を研究するための柔軟性を提供する。阻害剤は、二次抗体と架橋する前に添加することができるので、阻害剤はその標的に関与する時間を持っている。しかし、研究は、阻害剤の前処理の最適な時間を決定するために行われるべきです;したがって、阻害剤は刺激に最大の効果を有する。それと, 研究者はまた、刺激後の阻害剤の効果を研究することを選択することができます。.この場合、阻害剤は、既に生成された信号およびプロセスにどのように影響するかを研究するために架橋後に添加され得る。一緒に、ここで説明する方法は、治療抗体を有する異なる低分子阻害剤の組み合わせ効果を研究する上で最大の柔軟性を提供する。
前述のように、刺激後に様々な読み出しを行うことができる。ウエスタンブロッティングは、SDS-PAGEおよび様々なベンダーからの膜移動システムを使用して信号を研究するために行うことができます。同様に、遺伝子発現は、様々なRNA抽出法、逆転写試薬、および遺伝子発現装置を用いて評価することもできる。最後に、細胞内または細胞外タンパク質の染色は、異なるフローサイトメーターを用いてサンプルを分析できる方法で行うこともできます。細胞内サイトカインとCD107a染色(ステップ3.4、同時に評価することができる)の場合、モネンシンおよび/またはブレフェルジンAを添加してシグナルを最大化する必要があります。我々は、各実験目標に異なるプラットフォームを使用し、まだ同様の結果を観察しました。したがって、この方法は、研究に応じて、様々な試薬、プラットフォーム、および器具で補完することができます。
刺激のための架橋時間は、研究の目的に依存します.シグナル伝達研究が望まれる場合、典型的な架橋刺激時間は、2分と10分の間であるpAKT、pPRAS40、およびpERK1/2は2分でピークに蓄積し、10分8、9後に消失する。機能研究(すなわち、ケモカイン/サイトカイン産生を伴うもの)については、細胞は、分析物9に応じて、少なくとも30分間刺激されなければならない。遺伝子発現解析も通常、30分の刺激9を必要とする。RANTESのmRNA産生は、刺激時にタンパク質の迅速な翻訳および放出のために細胞内に既に保存されているため、RANTES遺伝子発現を読み出しとして使用する場合は注意が必要である。脱顆粒化は、対照的に、少なくとも3時間の刺激を必要とする。これらの一般的な観察にもかかわらず、研究者は、関心のある特定の分子に最適な刺激時間を決定するために運動研究を行う必要があります。
同様に、研究者は、異なる特異性を有する抗体が同じアイソタイプであっても、異なる親和性を有するFcγRIIIaに結合するため、最適な濃度を決定するために目的の抗体を評価する必要があります。例えば、リツキシマブおよびトラスツズマブはともにIgG1アイソタイプであるが、トラスツズマブはリツキシマブ26、27よりもFcγRIIIaのバリン多型に強く結合する。この親和性の違いは、公表された研究8で観察されるように、脱顆粒化などの機能的な違いをもたらす可能性がある。
最適濃度の決定も、抗体のFc部分がFcγRIIIaに対して持っている親和性が低いために重要である。これは、プロトコルがFc受容体に抗体を結合した後の洗浄ステップを含むので、抗体を洗い流してしまう可能性がある。これは、刺激後のCD107a陽性細胞の低率によって示唆されるようにアッセイにおける感受性の欠如につながる可能性がある(図5)。しかし、最適濃度の決定は、結果が感度の欠如によるものではないという確信を与えるべきである。また、単一細胞読み出しとは対照的にバルクセルを使用する生化学的および機能的アッセイにおいて細胞が明確に活性化される(図2、図3、図6)。
プロトコルは、生理学的に起こることを完全に模倣していないので、また制限されています。また、使用される二次抗ヒトK抗体は、細胞上に発現する標的抗原によって発生する架橋を模倣することである。ここで、最大応答を生成するために二次抗体の飽和量が添加される。しかし、異なる標的細胞は異なるレベルの抗原を発現し、架橋や応答に影響を及ぼす。現在、このプラットフォームは、異なる抗原発現レベルの効果を模倣するように最適化されていません。
これらの実験を行う際に考慮すべきもう一つの要因は、個人間の異なる遺伝的背景および免疫学的歴史によるドナー間の変動である。したがって、同じアッセイで異なるドナーからのNK細胞応答を比較する際には注意が必要です。同様に、異なるドナーを使用する場合は、一般的な結論のみを行う必要があります。
全体として、記載された方法は、NK細胞における抗体駆動FcγRIIIa媒介事象を研究するための単純で柔軟な刺激プラットフォームである。これは、アフコシル化抗体8で観察されたADCCおよび有効性の増加の基礎をよりよく理解するために使用されてきた。この方法は、治療用抗体とPI3K低分子阻害剤9を組み合わせた研究においても採用された。さらに、pS6によって調節されたケモカインおよびサイトカイン産生のための未知のメカニズムが9を同定した。したがって、この人工シグナル伝達プラットフォームを用いた今後の研究は、FcγRIIIaによって駆動されるエフェクター機能の調節機構をさらに解明することができる。また、これらのメカニズムにとって重要な新しい分子や、既知の分子の新しい役割を同定する可能性もあります。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、この原稿のコメントと編集のためにジェームズ・リーとクリストファー・ンに感謝します。
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |