Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Summary

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Abstract

Les lipoprotéines des protéobactéries sont modifiées post-traductionnellement par des acides gras dérivés des phospholipides membranaires par l’action de trois enzymes membranaires intégrales, ce qui donne des protéines triacylées. La première étape de la voie de modification des lipoprotéines implique le transfert d’un groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine, ce qui entraîne la prolipoprotéine diacylglycéryle. Dans la deuxième étape, le peptide signal de la prolipoprotéine est clivé, formant une apolipoprotéine, qui à son tour est modifiée par un troisième acide gras dérivé d’un phospholipide. Cette dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt). La voie de modification des lipoprotéines est essentielle dans la plupart des γ-protéobactéries, ce qui en fait une cible potentielle pour le développement de nouveaux agents antibactériens. Décrit ici est un test sensible pour le Lnt qui est compatible avec le criblage à haut débit de petites molécules inhibitrices. L’enzyme et les substrats sont des molécules enfouies dans la membrane; Par conséquent, le développement d’un test in vitro n’est pas simple. Cela comprend la purification de l’enzyme active en présence de détergent, la disponibilité d’alcynes-phospholipides et de substrats peptidiques diacylglycéryliques, et les conditions de réaction dans des micelles mixtes. De plus, afin d’utiliser le test d’activité dans une configuration de criblage à haut débit (HTS), la lecture directe du produit de réaction est préférable aux réactions enzymatiques couplées. Dans ce dosage enzymatique fluorométrique, le produit peptidique alcyne-triacylé est rendu fluorescent par une réaction de chimie de clic et détecté dans un format de plaque multipuits. Cette méthode est applicable à d’autres acyltransférases qui utilisent des substrats contenant des acides gras, y compris les phospholipides et l’acyl-CoA.

Introduction

Les lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par des acides gras liés par covalence au niveau de leurs amino-terminus à travers lesquels elles sont ancrées dans les membranes ^1,2. La partie mature de la protéine est très diversifiée dans sa structure et sa fonction, ce qui explique le rôle des lipoprotéines dans divers processus biologiques dans l’enveloppe cellulaire bactérienne.

Les lipoprotéines sont modifiées par les acides gras dérivés des phospholipides après insertion dans la membrane cytoplasmique. Les prolipoprotéines contiennent un motif de signature, la lipobox, qui contient un résidu de cystéine invariant qui devient acylé et le premier acide aminé dans la protéine mature. La première étape de cette voie est catalysée par la prolipoprotéine phosphatidylglycérol::d iacylglycéryl transférase (Lgt), qui transfère le groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine via un lien thioéther entre le diacylglycéryle et la cystéine. La peptidase signal II (Lsp) clive le peptide signal de la prolipoprotéine diacylglycéryle, ce qui donne une apolipoprotéine qui est ancrée dans la membrane par sa fraction diacylglycéryle. La troisième et dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt), qui ajoute un acide gras de la position sn-1 du phospholipide sur l’apolipoprotéine, ce qui donne des lipoprotéines matures triacylées (Figure 1)³. La réaction Lnt est une réaction de ping-pong en deux étapes où un intermédiaire de l’enzyme acyle thioester stable est formé. Le sous-produit lysophospholipide est libéré avant l’acylation du substrat de l’apolipoprotéine dans la deuxième étape de la réaction.

La spécificité du substrat phospholipide est déterminée dans un test Lnt basé sur le décalage de mobilité du peptide N-acyl diacylglycéryle sur un pourcentage élevé de tris-tricine urée SDS-PAGE⁴. Les phospholipides avec de petits groupes de tête polaires, saturés [sn-1] et non saturés [sn-2], étaient des substrats préférés ⁴. Le test de décalage de gel n’est pas approprié pour des études cinétiques approfondies de l’apolipoprotéine N-acyltransférase ni pour que HTS identifie des molécules inhibitrices. La chimie du clic utilisant des acides gras alcynes a été utilisée avec succès pour étudier la modification des lipoprotéines chez les bactéries⁵ et le métabolisme des acides gras chez les eucaryotes⁶. Récemment, un essai in vitro de Ras palmitoylation a été signalé pour identifier les inhibiteurs⁷.

Dans la méthode décrite ici, le Lnt actif purifié dans le détergent est incubé avec des substrats dans des micelles mixtes pour former un peptide alcyne-triacylé qui est ensuite détecté par spectrométrie de fluorescence.

Protocol

1. Préparation d’enzymes et de substrats Purification de l’enzyme Produire et purifier l’enzyme Lnt à partir de membranes solubilisées détergentes comme décrit précédemment 4,8. Brièvement, induire l’expression du gène lnt-streptocoque, codant pour Lnt avec un marqueur streptococcique C-terminal, à OD 600 de 0,6 avec de la tétracycline anhydre (200 ng/mL) à 37 °C pendant 16 h. <li…

Representative Results

Dans la réaction Lnt, l’acide gras sn-1 des phospholipides est transféré sur un peptide diacylglycéryle, ce qui donne un peptide triacylé8 mature. Le test Lnt in vitro décrit ici est conçu pour utiliser des phospholipides contenant un acide gras alcyne (alcyne-POPE) et FSL-1-biotine comme substrats, entraînant la formation d’alcyne-FSL-1-biotine. Lors d’une réaction de chimie de clic avec l’azido-FAM, ce produit doit être marqué par fluorescence et détecté par spectro…

Discussion

Le protocole du test Lnt décrit ici, basé sur la détection par fluorescence du produit triacylé, est sensible et reproductible. La liaison spécifique et efficace de la biotine à la streptavidine est un élément clé du test. Le substrat alcyne-POPE laissé après l’achèvement de la réaction Lnt est également marqué par fluorescence avec FAM, mais est efficacement éliminé après s’être lié aux plaques de streptavidine par plusieurs étapes de lavage. De plus, l’ajout de DMSO n’affecte pas l’activi…

Materials

Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation