डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके एकल सेल स्तर पर उम्मीदवार जीन के वंश ट्रेसिंग और कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। MADM क्लोनल विश्लेषण उत्पादक व्यवहार, सेलुलर उत्पादन, और व्यक्तिगत जनक और उनकी बेटी कोशिकाओं के वंश संबंध को मापने के लिए एक मात्रात्मक ढांचा प्रदान करता है।
जनकों के एक सीमित पूल से शुरू, स्तनधारी सेरेब्रल कॉर्टेक्स अत्यधिक संगठित कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट बनाता है। हालांकि, अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के वंश संक्रमण और विकासशील न्यूरोएपिथेलियम में न्यूरॉन्स और ग्लिया के अंतिम उत्पादन को विनियमित करने वाले अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र अस्पष्ट बने हुए हैं। एनएससी डिवीजन पैटर्न का पता लगाने और क्लोनली से संबंधित कोशिकाओं के वंश को मैप करने के तरीके नाटकीय रूप से उन्नत हुए हैं। हालांकि, कई समकालीन वंश अनुरेखण तकनीकों जनक कोशिका भाग्य है, जो जनक सेल विभाजन पैटर्न समझने के लिए आवश्यक है के सेलुलर संकल्प की कमी से पीड़ित हैं । प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल डबल मार्कर (MADM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण का उपयोग करने के लिए वीवो क्लोनल विश्लेषण में प्रदर्शन है । MADM सहवर्ती व्यक्तिगत जनक कोशिकाओं में हेरफेर और अभूतपूर्व एकल सेल संकल्प पर सटीक विभाजन पैटर्न और वंश प्रगति कल्पना । माइटोसिस के जी-एक्स चरण के दौरान एमएडीएम-आधारित इंटरक्रोमोमोमोमल पुनर्संयोजन घटनाओं, अस्थायी रूप से अपरिवर्तनीय क्रेयरटी 2के साथ, क्लोन की जन्म तिथि और उनके विभाजन पैटर्न के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करते हैं। इस प्रकार, एमएडीएम वंश ट्रेसिंग एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल जनकों के प्रसार मोड के अभूतपूर्व गुणात्मक और मात्रात्मक ऑप्टिकल रीडआउट प्रदान करता है। एमएडीएम एनएससी वंश प्रगति में उम्मीदवार जीन के तंत्र और कार्यात्मक आवश्यकताओं की जांच के लिए भी अनुमति देता है। यह विधि नियंत्रण के तुलनात्मक विश्लेषण में अद्वितीय है और उत्परिवर्ती उपकमान वीवो में एक ही ऊतक वातावरण में किया जा सकता है। यहां, प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया गया है, और विकासशील सेरेब्रल कॉर्टेक्स में क्लोनल विश्लेषण और वंश अनुरेखण के लिए एमएडीएम को नियोजित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रदर्शन किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल को किसी भी मुरीन स्टेम सेल आला में MADM क्लोनल विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक कि क्रेयरटी 2 ड्राइवर मौजूद है।
सेरेब्रल कॉर्टेक्स एक अत्यधिक संगठित संरचना है जो छह अलग-अलग परतों से बना है। कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स और ग्लिया सहित सेल प्रकारों की एक विविध सरणी होती है, जो कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट बनाने के लिए बातचीत करती है। अधिकांश, यदि सभी नहीं, कॉर्टिकल उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और ग्लिया तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के एक आम पूल से प्राप्त होते हैं जिसे रेडियल ग्लियल प्रोजेनिटर (आरजीपी)1,,2,,3के रूप में जाना जाता है। आरजीपी स्वयं न्यूरोएपिथेलियल स्टेम सेल (एनएससी) से प्राप्त होते हैं जो प्रारंभिक भ्रूण न्यूरोएपिथेलियम की रचना करते हैं। चूहों में भ्रूणीय दिन 9 (E9) से, NESCs RGPs4में संक्रमण शुरू करते हैं । आरजीपी वंश प्रगति सटीक लौकिक और स्थानिक विनियमन की आवश्यकता है, और जब इस प्रक्रिया में रुकावट है, इस तरह के megalencephaly, माइक्रोसेफली, लिसेंसेफली, या एक प्रकार का पागलपन और आत्मकेंद्रित के रूप में हानि के रूप में गंभीर तंत्रिका संबंधी विकारों5,,6परिणाम कर सकते हैं । E10 में, अधिकांश आरजीपी सममित प्रोलिफेरेटिव डिवीजनों से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप तंत्रिका जनक पूल4, 7,का विस्तारहोताहै। आरजीपी अंततः विषम रूप से विभाजित करना शुरू करते हैं, जो अस्थायी रूप से परिभाषित तरीके से कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स का उत्पादन करते हैं। न्यूरोजेनेसिस की लगातार तरंगों के माध्यम से, नवजात न्यूरॉन्स कॉर्टिकल प्लेट में स्थानांतरित हो जाते हैं, जिसमें प्रारंभिक जन्म वाले न्यूरॉन्स गहरी परतों पर कब्जा करते हैं और सतही परतों में रहने वाले स्वर्गीय जन्मे न्यूरॉन्स8,,9,,10। क्योंकि क्लोन रूप से संबंधित पिरामिड न्यूरॉन्स बहुत कम स्पर्शरेखा फैलाव के साथ कॉर्टेक्स में मूल रूप से स्थानांतरित हो जाते हैं, इसलिए बेटी की कोशिकाएं एक स्तंभ या शंकु के आकार की संरचना बनाती हैं जिसे न्यूरोनल रेडियल यूनिट 4,,11,12, 13के रूप में संदर्भित कियाजाताहै।11, E17 तक, भ्रूण न्यूरोजेनिक विस्तार चूहों14में पूरा हो गया है । आरजीपी एपेंडिमल कोशिकाओं और ग्लिया के कुछ वर्गों का उत्पादन भी कर सकते हैं, जिनमें एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स1,15, 16,,,16,17, 18,,,19शामिल हैं।18 न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स दोनों को जन्म देने की आरजीपी की क्षमता सभी कॉर्टिकल क्षेत्रों में सुसंगत प्रतीत होती है18, न्यूरोजेनिक आरजीपी के लगभग 1/6 के साथ भी ग्लिया11का उत्पादन होता है ।
वर्तमान में, आनुवंशिक और एपीजेनेटिक अपने वंश के साथ एक स्टेम सेल की लौकिक प्रगति को विनियमित कारक ज्यादातर अज्ञात हैं । जीन अभिव्यक्ति के लौकिक पैटर्न का आरजीपीएस20 , 21 , 22,,,23,,24में वंश निर्णयों पर काफी प्रभाव पड़सकताहै .21 कैसे लौकिक और स्थानिक पैटर्निंग के बीच यह कसकर बुनना संबंध कॉर्टिकल क्षेत्रों में वयस्क न्यूरोनल प्रकार की आणविक विविधता की ओर जाता है ज्ञात नहीं है। इसी तरह, कैसे व्यक्तिगत स्टेम सेल क्षमता और उसके सेलुलर उत्पादन सेलुलर और आणविक स्तर पर संग्राहक है एक महत्वपूर्ण अनुत्तरित सवाल है । भविष्य के अध्ययन उम्मीद है कि इन सवालों में से कुछ का पता होगा, अंततः कार्यात्मक कॉर्टिकल सर्किट गठन की हमारी समझ का विस्तार.
विकासात्मक न्यूरोबायोलॉजी वंश संबंध को समझना चाहता है जो मस्तिष्क में कोशिकाएं एक-दूसरे के साथ साझा करती हैं। प्रारंभ में, इसके लिए बहुत कम शोध उपकरण उपलब्ध थे, और कई शुरुआती अध्ययनों ने पारदर्शी जीवों जैसे कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस25में विभाजन पैटर्न की दृश्य टिप्पणियों पर भरोसा किया। हाल के दशकों में उपलब्ध तकनीकों की संख्या और परिष्कार में नाटकीय वृद्धि देखी गईहै , 13,26,27,28,29,29. CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के उद्भव27,,30विकसित डीएनए बारकोड शुरू करके सेल वंश संबंधों के सिंथेटिक पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है । बारकोडिंग रणनीतियों के दो हालिया उदाहरणों में होमिंग गाइड आरएनए का उपयोग शामिल है जो CRISPR-Cas9 को विशिष्ट डीएनए बारकोड लोकी या एक साइटिडीन डेमिनास को निर्देशित करता है जो एंडोजेनस इंटरप्रेड रिपीट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए निक्स के साथ जुड़ा हुआ है31,,32। ये प्रौद्योगिकियां बारकोड की शुरूआत के माध्यम से अत्यधिक मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण प्रदान करती हैं जो उत्तरोत्तर और समय के साथ अद्वितीय उत्परिवर्तन जमा करती हैं। जीनोम संपादन दृष्टिकोण अत्यधिक मूल्यवान हैं क्योंकि वे इन बारकोड की साझा विरासत के आधार पर किसी भी दो कोशिकाओं के बीच संबंधों के पूर्वव्यापी विश्लेषण की अनुमति देते हैं। हालांकि, व्यक्तिगत कोशिकाओं में बारकोड पढ़ने के लिए, ऊतक आमतौर पर बाधित किया जाना चाहिए, और इसलिए एक व्यक्तिगत जनक से स्थिति, आकृति विज्ञान, और पूर्ण कोशिका संख्या के बारे में जानकारी खो जाती है।
संयोजन लेबलिंग प्रतिमान स्थानिक सूचनाओं को संरक्षित करते हैं और सैद्धांतिक रूप से33 , 34,क्लोन के बारीकी से स्थानीयकृत या ओवरलैपिंग क्लोन के बीच अंतर की अनुमति भीदेतेहैं । एक वंश अनुरेखण विधि के लिए जानकारीपूर्ण होने के लिए यह एक विरल और अमिट तरीके से व्यक्तिगत जनक और उनकी संतान लेबल होना चाहिए । विशेष रूप से, ब्रेनबो35 और कंफ़ेटी36,,37 दृष्टिकोण स्टोचस्टिक मल्टीकलर क्रे रिकॉम्बिनेज-आधारित रिपोर्टर्स का उपयोग करते हैं जो एक ही लोकस से फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संयोजन व्यक्त करते हैं। वीवो में प्राप्त किए जा सकने वाले रंग संयोजनों की व्यापक संख्या कॉर्टिकल आरजीपी क्लोन और एस्ट्रोसाइट्स34का पता लगाते समय इसे एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को एन्कोडिंग करने वाले ट्रांसजीन के स्थिर जीनोमिक एकीकरण और कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स के वंश का पता लगाने की अनुमति प्रदान करने वाली ट्रांसपोसन आधारित प्रणालियों को भी विकसित किया गया है33,,38, 39,,40,,,41।40 ट्रांसपोसन आधारित प्रणालियों में एक अतिरिक्त लाभ है कि रिपोर्टर का निर्माण स्थिर जीनोम में एकीकृत है, और इस तरह मज़बूती से लाइनली संबंधित बेटी कोशिकाओं लेबल । विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट वंश का पता लगाने के लिए, कई तरीके विकसित किए गए हैं जिनमें स्टार ट्रैकसहित पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस का विद्युतपंचाल शामिल है, जो विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन40,,42को एन्कोडिंग करने वाले निर्माणों के संयोजन का उपयोग करता है। एक अन्य दृष्टिकोण, मैजिक मार्कर,ब्रेनबो वैक्टर को ट्रांसपोज़ेबल ट्रांसजीन के रूप में पेश करता है। इसका उपयोग भ्रूणीय तंत्रिका और एस्ट्रोसाइट जनकों का पता34,लगाने के लिए सफलतापूर्वक किया गयाहै। हाल ही में, दोहरी रिकॉम्बिनेंट-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (एमएडीआर) द्वारा मोज़ेक विश्लेषण को ठीक परिभाषित क्रोमोसोमल लोकी44से ट्रांसजेनिक तत्वों को व्यक्त करने वाले उत्परिवर्ती कोशिकाओं को स्थिर रूप से लेबल करने के लिए पाया गया था। वीवो एंव इंडिवेटोरियल लेबलिंग तकनीकों में ये शक्तिशाली जनक कोशिकाओं की वंश गतिशीलता में कई अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, ये विश्लेषण निश्चित ऊतक पर किए जाते हैं, जो एक परिभाषित विकासात्मक चरण में व्यक्तिगत क्लोन का स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। समय के साथ एकल क्लोन की वंश गतिशीलता में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, वयस्क दंतेट जाइरस में प्रदर्शन करने वालों के समान वीवो इमेजिंग विधियों में पुरानी45लागू करने की आवश्यकता है।
डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण एक शक्तिशाली दोहरी रंग लेबलिंग विधि है जो चूहों46, 47,47में व्यक्तिगत जनक कोशिकाओं के वीवो वंश ट्रेसिंग में सक्षम बनाता है। एमएडीएम लेबलिंग घटनाओं के लिए दो घटक आवश्यक हैं: सबसे पहले, एमएडीएम कैसेट को समरूप गुणसूत्रों पर समान लोकी के लिए लक्षित किया जाना चाहिए। कैसेट दो चिमरिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, eGFP (ग्रीन, [जी]) और मिलकर dimer टमाटर (लाल, टीडीटी [टी]) से मिलकर होते हैं । जीटी कैसेट में ईजीएफपी के एन-टर्मिनस और टीडीटी के सी-टर्मिनस होते हैं, जो एक लोक्सपी साइट वाले इंट्रॉन से अलग होते हैं। टीजी कैसेट का निर्माण टीडीटी के एन-टर्मिनस और ईजीएफपी के सी-टर्मिनस के साथ किया जाता है। दूसरा, लक्षित एमएडीएम कैसेट युक्त एक ही सेल में क्रे रिकॉम्बेमिने की अभिव्यक्ति आवश्यक है। क्रेकी अनुपस्थिति में, चिमरिक कैसेट कार्यात्मक ईजीएफपी या टीडीटी व्यक्त नहीं करते हैं क्योंकि उनके कोडिंग दृश्य बाधित होते हैं। लोक्सपी साइटें क्रे-मध्यस्थता इंटरक्रोसोमोमल पुनर्संयोजन के लक्ष्य के रूप में काम करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप दोनों अभिव्यक्ति कैसेट का पुनर्गठन एक साथ होता है। यदि कोशिका चक्र के जी-2 चरण के दौरान पुनर्संयोजन होता है और इसके बाद एक्स अलगाव (जी2-एक्स) होता है, तो दो बेटी कोशिकाएं प्रत्येक दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक को व्यक्त करेंगी। टैमोक्सिफेन (टीएम) का उपयोग करके क्रेयरटी – 2 गतिविधि का अस्थायी विनियमन एमएडीएम क्लोन की जन्म तिथि और उनकी संतान के विभाजन पैटर्न(चित्र 1ए)29,46,,47के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है।,
MADM संभावित रूप से व्यवस्थित रूप से पारंपरिक लेकिन गैर विशिष्ट और श्रमसाध्य तरीकों जैसे गोलगी धुंधला48 या डाई भरने49जैसे माउस मस्तिष्क में उच्च एकल सेल संकल्प के साथ व्यक्तिगत क्लोन लेबल कर सकते हैं। क्योंकि केवल प्रमोटर ड्राइविंग क्रेयरटी 2 क्लोनल एमएडीएम लेबलिंग की सेल प्रकार विशिष्टता निर्धारित करता है, MADM सैद्धांतिक रूप से किसी भी मुरीन अंग और ऊतक,47,50, 51, 52,51भर में क्लोनल वंश ट्रेसिंग के लिए लागू किया जा सकता है।,52 वास्तव में , अध्ययनों में पहले से ही एमएडीएम का उपयोग विविध ऊतकों,,55,47, 50 , 51 , 5257,,53,54,56,,,5258,58,59से प्राप्त क्लोनों में वंश संबंधों को प्रकट करने के लिए किया गया है ।5859 एमएडीएम के प्रायोगिक प्रतिमान विकसित नियोकॉर्टेक्स,62,7,,6111, 12,,,,,60, 61, 62, 63,6364,6465में कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स, ग्लियाऔर12प्रसवोत्तर स्टेम कोशिकाओं में वंश का अध्ययन करने के लिए लागू किए गए हैं।, एमएडीएम का उपयोग वयस्क डेंटेट जाइरस, थैलेसीमिया, सेरिबेलर ग्रेन्यूल कोशिकाओं और क्लोनल स्तर पर इंटरन्यूरॉन्स (पूरी सूची के लिए तालिका 1 देखें)47,53, 54,,54,56,57,,66में सेल वंश का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है।,,
एमएडीएम की एक अनूठी विशेषता आनुवंशिक रूप से म्यूटेशन को एक एमएडीएम कैसेट से जोड़ने की क्षमता है, जिससे एक आनुवंशिक मोज़ेक(चित्रा 1B और चित्रा 2)बना है। यह जंगली प्रकार की बेटी कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट मार्कर (चित्रा 1 बीमें टीडीटी) और दूसरे के साथ होमोज़िगस उत्परिवर्ती भाई बहन (चित्रा 1 बीमें eGFP) एक अवेलेबल विषम वातावरण में लेबल में परिणाम है । MADM नियंत्रण के तुलनात्मक विश्लेषण में अद्वितीय है और उत्परिवर्ती उपकमान वीवो में एक ही ऊतक वातावरण में किया जा सकता है। मूल रूप से, MADM कैसेट Rosa26 लोकस47में लक्षित किया गया था, लेकिन जीन समारोह के MADM विश्लेषण लोकस के लिए डिस्टल जीन तक ही सीमित था। इस सीमा को दूर करने और एमएडीएम-आधारित जीन विश्लेषणों के लिए संभावनाओं का विस्तार करने के लिए, एमएडीएम कैसेट को Chr. 751,Chr. 1146,और Chr. 1251के सेंट्रोमर के करीब खटखटाया गया था। MADM कैसेट के साथ सभी 19 माउस autosomes लक्ष्यीकरण प्रगति पर है और लगभग किसी भी जीन के लिए भविष्य में अध्ययन करने की अनुमति होगी, कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण के साथ संयोजन में विकासात्मक वंश संबंधों के अध्ययन के लिए एक अद्वितीय मंच प्रदान करते हैं ।
विकासशील नियोकॉर्टेक्स में वीवो में व्यक्तिगत आरजीपी के सेल वंश को ट्रैक करने के लिए एमएडीएम का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। जब टीएम-अक्षुण्ण क्रेयरटी 2के साथ संयुक्त किया जाता है, तो एमएडीएम घटनाओं को ठीक से समय पर किया जा सकता है, जो एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल डिवीजन पैटर्न का अत्यधिक गुणात्मक और मात्रात्मक दृश्य रीडआउट प्रदान करता है। टीएम डिलीवर की खुराक को तितर-लिखे करके, एक आदर्श स्थिति में प्रति कॉर्टिकल गोलार्द्ध में एक से कम क्लोन का औसत प्राप्त किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से व्यक्तिगत क्लोनों को अलग करने के लिए पर्याप्त स्थानिक पृथक्करण प्रदान करता है। ऊतक अखंडता को बनाए रखने के द्वारा, इस विधि भी स्थिति, आकृति विज्ञान, और निरपेक्ष सेल संख्या के बारे में आवश्यक जानकारी कब्जा । सीआर 7 51 पर सीएचआर 117,,11, 12,,46,,12,56,,57पर एमएडीएम कैसेट और रोसा2647,53,,59 में मूल एमएडीएम का उपयोग एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण अध्ययन में किया गया है।,53 व्यक्तिगत कोशिकाओं का उच्च संकल्प आकृति विज्ञान और बेटी कोशिकाओं के क्लोनल संबंध दोनों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और स्टेम कोशिकाओं और उभरते क्लोन46,,52के प्रसार की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।
सीजेरियन सेक्शन और प्रसवोत्तर टाइमपॉइंट्स पर क्लोन के विश्लेषण के लिए पिल्ले को बढ़ावा देना प्रोटोकॉल में एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। टीएम-इलाज गर्भवती बांध की स्वास्थ्य स्थिति के आधार पर, सीजेरियन सेक्शन करना आवश्यक नहीं हो सकता है। हालांकि, एक पालक मां के साथ पिल्ले स्थापना अभी भी आवश्यक है, क्योंकि टीएम इलाज मां मुसीबत स्तनपान हो सकता है । विभिन्न क्रेयरटी-2 ड्राइवरों के साथ बढ़ावा देने की आवश्यकता में कोई अंतर नहीं देखा गया है । दोनों MADM लाइनों और पालक माताओं एक outbred सीडी-1 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा जाता है । यदि सीजेरियन सेक्शन आवश्यक नहीं है, तो प्रायोगिक पिल्ले उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले टीएम-इलाज गर्भवती बांध को 3R के सिद्धांतों के अनुसार अतिरिक्त प्रायोगिक प्रजनन के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है (ध्यान दें कि यह केवल तभी किया जा सकता है जब पशु प्रायोगिक लाइसेंस इस अभ्यास को मंजूरी दें)। पालक माताओं को जन्म देने के बाद 2 दिनों के भीतर पिल्ले को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उच्च सफलता दर देखा गया है जब पालक माताओं प्रयोगात्मक चूहों कि प्रोत्साहित किया जाना चाहिए के रूप में एक ही दिन पर जंम देते हैं । इसलिए, चरण 1.1 में प्रयोगात्मक संभोग के समानांतर पालक माताओं के लिए समय पर संभोग स्थापित करना महत्वपूर्ण है। मूल पालक मां के कूड़े के रूप में एक समान कूड़े की संख्या को बनाए रखने को बढ़ावा पिल्ले के जीवित रहने की दर में सुधार कर सकते हैं, और इसलिए मूल कूड़े के सभी के लिए कुछ को हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है । अतिरिक्त कदम है कि बढ़ावा देने में सुधार हो सकता है कूड़े और भोजन के साथ प्रयोगकर्ता के दस्ताने रगड़ शामिल है (दस्ताने की खुशबू को दूर करने के लिए); पालक मां के गंदे कूड़े और घोंसले के टुकड़ों के साथ सीजेरियन सेक्शन के बाद पिल्ले को धीरे से रगड़ना; और पालक माउस पिंजरे में उनके प्लेसमेंट से पहले पालक मां के पिल्ले के साथ निकट संपर्क में पिल्ले की नियुक्ति ।
अन्य रिपोर्टर-आधारित वंश ट्रेसिंग विधियों की तरह, एमएडीएम क्लोनल प्रयोगों के लिए इष्टतम क्रेयरटी-2 ड्राइवर का चयन करते समय सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस्तेमाल किए गए प्रमोटर को ब्याज की जनक आबादी में अस्थायी और स्थानिक दोनों को फिर से जोड़ना चाहिए। इस प्रमोटर ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कुछ प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न बदल सकते हैं या विकास के विभिन्न चरणों में खामोश हो सकते हैं। सेल प्रकार विशिष्टता में सुधार करने के लिए कई साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन, प्रत्येक अलग प्रमोटरों द्वारा संचालित, का उपयोग किया गया है। जब एक या दोनों पुनर्संयोजन एक ही कोशिका में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह कोशिका और उसकी संतान को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर74,75, 76,,,77के साथ लेबल करता है।,76 संक्षेप में, एक क्रेयरटी 2 ड्राइवर चुनना महत्वपूर्ण है जो जनकों की आबादी के लिए विशिष्ट है।
इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम क्लोन की पहचान है, क्योंकि सभी कोशिकाओं को एक पुनर्संयोजन घटना (चरण 8.1) से स्पष्ट रूप से प्राप्त किया जाना चाहिए। टीएम एकाग्रता का टिटरेशन मस्तिष्क गोलार्द्ध प्रति लाल/हरे रंग की कोशिकाओं के एक समूह से कम सुनिश्चित करता है और एक क्लोन (चरण 2.2)7,,11का विश्लेषण करने की संभावना को अधिकतम करता है। क्लोन को छोड़ दिया जाना चाहिए यदि कोशिकाओं के पड़ोसी समूह ब्याज के क्लोन के 500 माइक्रोन के भीतर होते हैं। इसलिए, क्लोन की उपस्थिति से पहले और बाद में कई वर्गों की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आसपास कोई अतिरिक्त पुनर्संयोजन घटनाएं नहीं हैं। फ्लोरोफोरस के कमजोर संकेत के कारण, भ्रूण क्लोन में ईजीएफपी और टीडीटी के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना आवश्यक है (धारा 6 देखें)। यह केवल वयस्क क्लोन में अनुशंसित है यदि अतिरिक्त एंटीजन को कोलेबल किया जाएगा। जब इमेजिंग क्लोन, यह प्रांतस्था की पूरी चौड़ाई पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, जहां क्लोन स्थित है (यानी, पायल सतह से कॉर्पस callosum के लिए; कदम ८.४ देखें) किसी भी कोशिकाओं को याद नहीं करने के लिए । यह इमेज प्रोसेसिंग (सेक्शन 9) के दौरान इमेज अलाइनमेंट की सुविधा भी देता है। प्रोटोकॉल की धारा 8 में एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है लेकिन उपलब्ध माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सिफारिश की जाती है क्योंकि इससे फोकस प्लेन के बाहर से प्रकाश संदूषण में कमी आती है। यह भी महत्वपूर्ण है कि लेजर तीव्रता और लाभ को समायोजित किया जाए ताकि हरे, लाल और पीले रंग की कोशिकाओं की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सके। सेटअप के बावजूद, बारीकी से तैनात कोशिकाओं का पूर्ण स्थानिक पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20x के उद्देश्य का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सभी कोशिकाओं (चरण 8.6) की कॉर्टिकल गहराई को रिकॉर्ड करने के अलावा, कॉर्टिकल क्षेत्र जहां क्लोन स्थित हैं, उन्हें मस्तिष्क एटलस जैसे एलन ब्रेन एटलस या अन्य टकसाली समन्वय मानचित्रों का उपयोग करके पहचाना जाना चाहिए। क्लोन छवियों को आसानी से पहचानने योग्य हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए एक फ़ाइल नामकरण प्रतिमान भी अपनाया जाना चाहिए। निम्नलिखित जानकारी फ़ाइल नामकरण में शामिल किया जा सकता है: अद्वितीय छवि आईडी, तिथि छवि लिया गया था, पशु का जीनोटाइप, प्रेरण की आयु, विश्लेषण की आयु, एक ही क्लोन से छवियों के बाकी के संबंध में छवि संख्या ।
एक एमएडीएम कैसेट में उत्परिवर्तन डिटल का परिचय विशिष्ट रूप से आनुवंशिक मोज़ेक71 के उत्पादन की अनुमति देता है और क्लोनल स्तर 7 ,11,46,,62,पर वंश और कोशिका प्रकार की विविधता के आणविक नियामकों के विच्छेदन की अनुमतिदेताहै। MADM के साथ एक आनुवंशिक पच्चीकारी उत्पन्न करने के लिए, MADM कैसेट को रुचि के जीन के रूप में एक ही गुणसूत्र से जुड़ा होना चाहिए (प्रजनन योजना के लिए चित्रा 2 देखें)। यह एमएडीएम के साथ वर्तमान क्लोनल विश्लेषण को सीएचआर 751,सीएचआर 1146,सीएचआर 1251और सीएचआर 6 डिस्टल से रोजा26 लोकस47पर स्थित जीन तक सीमित करता है। भविष्य के अध्ययनों से किसी भी गुणसूत्र के लिए लक्षित MADM कैसेट का उपयोग करेंगे, क्लोनल स्तर पर माउस जीनोम के लगभग सभी जीन के पच्चीकारी विश्लेषण की अनुमति ।
अंत में, एमएडीएम विकासशील नियोकॉर्टेक्स में जनक कोशिकाओं के विश्लेषण तक सीमित नहीं है। कई स्टेम सेल निकस के अध्ययन से क्लोनली संबंधित कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्थाओं को हल करने की क्षमता से लाभ हो सकता है। मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में एमएडीएम लागू करके, रोग की स्थिति (जैसे, कैंसर), या अन्य ऊतकों में47,50,,51,,52,,,53,,54,,55,56,,57,58,,59,अध्ययनों से पता चला कि जनक और स्टेम कोशिकाओं के विविध वर्गों से प्राप्त क्लोन में वंश संबंध (एमएडीएम क्लोनल अध्ययन की वर्तमान सूची के लिए तालिका 1 देखें)।,, एमएडीएम का एक और दिलचस्प भविष्य का अनुप्रयोग इसे अतिरिक्त कार्यात्मक या उपकोशिकीय संवाददाताओं के साथ जोड़ना है, जो क्लोन से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी की डिग्री को बढ़ाएगा।
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा के लिए Hippenmeyer प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद, जैवएजिंग सुविधा, जीवन विज्ञान सुविधा, और पूर्व नैदानिक सुविधा IST ऑस्ट्रिया में तकनीकी सहायता के लिए । इस काम को आईएसटी ऑस्ट्रिया संस्थागत कोष द्वारा समर्थित किया गया था; आरबी को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) लिसे-मीननर कार्यक्रम (एम 2416) से समर्थन मिला; एन. ए को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) फिरनबर्ग-प्रोग्राम (टी 1031) से समर्थन मिला; जीसी को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 754411 के तहत आईएसटीप्लस पोस्टडॉक्टोरल फेलो के रूप में समर्थन मिला; A.H. एक ÖAW डॉक्टर (ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी के डॉक्टरेट फैलोशिप) से समर्थन प्राप्त किया । इस अध्ययन को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता संख्या ७२५७८० LinPro) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) द्वारा एसएच को भी समर्थन दिया गया ।
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 9204512N | |
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) | Roth | 0718.2 | |
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 8508429N | |
15 mL conical centrifuge | Sarstedt | 65.554.502 | |
24 multi-well dishes | Roth/Greiner Bio-one | CE56.1 | |
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) | Braun | 16010256E | |
Corn oil | Sigma | C8267-500ML | |
Coverslips (24 x 60 mm #1) | Thermo Fisher Scientific (Menzel) | 15747592 | |
Cryostat Cryostar NX70 | Thermo Fisher Scientific | 957000H | |
Dako Pen (Wax marker) | Agilent | S200230-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) | Thermo Fisher Scientific | 705830 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
Glass anti-roll plate | Histocom | M 449980 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
LSM 800 Confocal | Zeiss | ||
Mounting medium | 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) | ||
Mowiol 4-88 | Roth | 0713.2 | |
Normal donkey serum | Innovative Research | IGDNSER100ML | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244-1KG | |
Peristaltic pump 323E/D 400RPM | Watson-Marlow | 036.3124.00A | |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | |
Superfrost plus glass slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNT | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) | Polysciences Inc. | 18986-1 | |
Tissue-Tek O.C.T | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Trizma hydrochloride | Sigma | 93363 | |
Tween-20 | Sigma | P9416-100ML | |
Software and Plugins: | |||
Fiji | 1.52p | Fiji | |
MultiStackReg | 1.45 | Download link | |
TurboReg | EPFL Bioimaging | ||
Zen Blue | 2.6 | Zeiss | |
Experimental Models: Organisms/Strains: | |||
Mouse: Emx1-CreER | The Jackson Laboratory | JAX:027784 | |
Mouse: MADM-11-GT | The Jackson Laboratory | JAX:013749 | |
Mouse: MADM-11-TG | The Jackson Laboratory | JAX:013751 | |
Primary antibodies: | |||
Chicken anti-GFP 1:500 | Aves Labs | GFP-1020 | |
Goat anti-tdTomato 1:500 | Sicgen Antibodies | AB8181-200 | |
Rabbit anti-RFP 1:500 | MBL | PM005 | |
Secondary antibodies: | |||
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 | Jackson Immuno Research | 715-475-150 | |
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | |
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 711-165-152 |