Um sistema gnotobiótico para estudar a montagem do microbioma na Fistofera e na Fermentação Vegetal
Summary
Foi desenvolvido um método de cultivo de repolhos Napa sem germes que permite aos pesquisadores avaliar como espécies microbianas únicas ou comunidades microbianas multiespécies interagem em superfícies de folhas de repolho. Também é apresentado um extrato vegetal estéril que pode ser usado para medir mudanças na composição da comunidade durante a fermentação vegetal.
Abstract
A filosfera, a porção acima do solo da planta que pode ser colonizada por micróbios, é um sistema modelo útil para identificar processos de montagem comunitária microbiana. Este protocolo descreve um sistema para estudar a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera das plantas de repolho Napa. Descreve como cultivar plantas livres de germes em tubos de ensaio com um substrato de argila calcinada e caldo de nutrientes. A inoculação de plantas livres de germes com culturas microbianas específicas oferece oportunidades para medir o crescimento microbiano e a dinâmica comunitária na filosfera. Através do uso de extrato vegetal estéril produzido a partir de repolhos, também podem ser avaliados os deslocamentos em comunidades microbianas que ocorrem durante a fermentação. Este sistema é relativamente simples e barato de ser criado em laboratório e pode ser usado para abordar questões ecológicas importantes na montagem da comunidade microbiana. Também oferece oportunidades para entender como a composição da comunidade da filosfera pode impactar a diversidade microbiana e a qualidade das fermentações vegetais. Essa abordagem para o desenvolvimento de comunidades de filosfera de repolho gnotobiótico poderia ser aplicada a outras espécies de plantas selvagens e agrícolas.
Introduction
A diversidade microbiana da fisfera desempenha um papel importante na manutenção da saúde vegetal e também pode influenciar a capacidade das plantas de suportar o estresse ambiental1,,2,3,4,,5. Por sua vez, a saúde das culturas impacta diretamente na segurança alimentar e na qualidade6,7. As plantas desempenham um papel no funcionamento do ecossistema e seus microbiomas associados afetam tanto a capacidade das plantas de realizar essas atividades como influenciam diretamente o meio ambiente8. Embora os cientistas tenham começado a decifrar a função e a composição da filosfera, os processos ecológicos que influenciam a montagem da comunidade microbiana da filosfera não são totalmente compreendidos9,,10. O microbioma da fisfera é um excelente sistema experimental para estudar a ecologia dos microbiomas11. Essas comunidades são relativamente simples e muitos dos membros da comunidade podem ser cultivados em mídia de laboratório padrão10,,12,,13.
Vegetais fermentados são um sistema onde a estrutura comunitária da filosfera tem consequências importantes. Tanto no chucrute quanto no kimchi, os micróbios que ocorrem naturalmente nas folhas vegetais (a filosfera da espécie Brassica) servem como o inóculo para a fermentação14,15. As bactérias do ácido láctico (LAB) são consideradas membros onipresentes de microbiomas vegetais, porém podem estar em baixa abundância na fisfera16. Uma forte seleção abiótica durante a fermentação impulsiona uma mudança na composição da comunidade microbiana, permitindo que as bactérias do ácido láctico aumentem em abundância. À medida que o LAB cresce, eles produzem ácido láctico que cria o ambiente ácido de produtos vegetais fermentados17. A ligação entre a fisfera e o fermento proporciona uma oportunidade de usar vegetais como modelo para entender como os microbiomas são estruturados.
Desenvolvemos métodos para cultivar repolhos Napa sem germes e inocula-los com comunidades microbianas específicas usando garrafas de spray. Trata-se de um método barato e confiável de inocular uniformemente o repolho com micróbios individuais ou comunidades mistas. Um extrato vegetal estéril (SVE) também foi desenvolvido a partir de três tipos/variedades diferentes de repolho: repolho vermelho e verde(Brassica oleracea) e repolho Napa (B. rapa). A adição de sal a essas PMEs replica o ambiente de fermentação e permite estudos experimentais de pequena escala e relativamente de alto rendimento da montagem de microbioma de fermentação. Esses métodos podem ser usados para estudar a montagem da comunidade microbiana na filosfera e como a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera pode estar ligada ao sucesso da fermentação vegetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
As plantas de repolho Napa livres de germes têm sido usadas para estudar a limitação dispersa de bactérias de ácido láctico na fisfera de repolho napa17. Repolhos Napa sem germes também podem ser usados para testar o crescimento individual ou par-wise na fisfera (Figura 1). Métodos para a fabricação de extrato vegetal estéril foram testados para três variedades diferentes de repolho: vermelho, verde e napa. Cada uma dessas SVEs atuam como uma mídia de cre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela subvenção do USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport e Claire Fogan forneceram suporte técnico e Ruby Ye e Casey Cosetta fornecem comentários úteis sobre as primeiras versões deste manuscrito.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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