Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem
Summary
Mikropsuz Napa lahanaları yetiştirme yöntemi, araştırmacıların tek mikrobiyal türlerin veya çok türlü mikrobiyal toplulukların lahana yaprağı yüzeylerinde nasıl etkileşimde bulunduklarını değerlendirmelerini sağlar. Steril bir sebze özü de sebze fermantasyon sırasında toplum kompozisyon vardiya ölçmek için kullanılabilir sunulmaktadır.
Abstract
Filosfer, mikroplar tarafından kolonize edilebilir bitkinin zemin üstü kısmı, mikrobiyal topluluk montaj süreçlerini belirlemek için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Napa lahana bitkilerinin fillosferindeki mikrobiyal topluluk dinamiklerini incelemek için bir sistem özetlemektedir. Bu bir kireçlenmiş kil ve besin suyu substrat ile test tüpleri mikropsuz bitkiler büyümek için nasıl açıklar. Mikrobuzsuz bitkilerin belirli mikrobiyal kültürlerle aşılanması, fillosferdeki mikrobiyal büyümeyi ve toplum dinamiklerini ölçmek için fırsatlar sağlar. Fermantasyon sırasında oluşan mikrobiyal topluluklarda lahanalardan üretilen steril sebze ekstresinin kullanımı da değerlendirilebilir. Bu sistem nispeten basit ve ucuz laboratuvarda kurmak ve mikrobiyal topluluk montaj önemli ekolojik sorulara hitap etmek için kullanılabilir. Ayrıca, fillosfer topluluk bileşiminin mikrobiyal çeşitliliği ve sebze fermantasyonlarının kalitesini nasıl etkileyip etkilebildiğini anlamak için fırsatlar sunar. Gnotobiyotik lahana fillosfer topluluklarının geliştirilmesi için bu yaklaşım diğer yabani ve tarımsal bitki türlerine uygulanabilir.
Introduction
Fillosferin mikrobiyal çeşitliliği bitki sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar ve aynı zamanda bitkilerin çevreselstresedayanma yeteneğini etkileyebilir 1,2,3,4,5. Buna karşılık, bitkilerin sağlığı doğrudan gıda güvenliği ve kalite6,7etkiler. Bitkiler ekosistem işleyişinde rol oynar lar ve bunlara bağlı mikrobiyomlar hem bitkilerin bu faaliyetleri yürütme yeteneğini etkiler hem de çevreyi doğrudan etkiler8. Bilim adamları phyllosphere fonksiyonu ve bileşimi deşifre etmeye başlamış olsa da, fillosfer mikrobiyal topluluk montaj etkileyen ekolojik süreçler tam olarak anlaşılamamıştır9,10. Fillosfer mikrobiyomu mikrobiyom11ekolojisini incelemek için mükemmel bir11deneysel sistemdir. Bu topluluklar nispeten basit ve topluluk üyelerinin çoğu standart laboratuvar medya10,12,,13yetiştirilebilir.
Fermente sebzeler, fillosferin toplum yapısının önemli sonuçları olduğu bir sistemdir. Hem lahana turşusu hem de kimchi’de, doğal olarak sebze yapraklarında (Brassica türlerinin fillosferi) oluşan mikroplar fermantasyon için inokül olarak hizmet vermektedir14,15. Laktik asit bakterileri (LAB) bitkisel mikrobiyomların her yerde üyeleri olarak kabul edilir, ancak onlar fillosfer de düşük bolluk olabilir16. Fermantasyon sırasında güçlü abiyotik seçimi, laktik asit bakterilerinin bolluğa artmasına olanak sağlayan mikrobiyal topluluk bileşiminde bir kaymaya yol açtır. LAB büyüdükçe, fermente bitkisel ürünlerin asidik ortamı nı oluşturan laktik asit üretirler17. Fillosfer ve fermantasyon arasındaki bağlantı mikrobiyomların nasıl yapılandırDığını anlamak için sebzeleri bir model olarak kullanma fırsatı sağlar.
Biz mikrop içermeyen Napa lahana büyümek ve sprey şişeleri kullanarak belirli mikrobiyal topluluklar ile aşılamak için yöntemler geliştirdik. Bu eşit ya bireysel mikroplar veya karışık topluluklar ile lahana aşılama ucuz ve güvenilir bir yöntemdir. Bir steril sebze özü (SVE) da üç farklı lahana türleri / çeşitleri geliştirilmiştir: kırmızı ve yeşil lahana(Brassica oleracea) ve Napa lahana(B. rapa). Bu SV’lere tuz ilavesi fermantasyon ortamını kopyalar ve fermantasyon mikrobiyom montajının küçük ölçekli ve nispeten yüksek iş lenmeli deneysel çalışmalarına olanak sağlar. Bu yöntemler, fillosferdeki mikrobiyal topluluk montajını ve fillosferdeki mikrobiyal topluluk dinamiğinin bitkisel fermantasyonun başarısıyla nasıl bağlantılı olabileceğini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikropsuz Napa lahana bitkileri Napa lahana phyllosphere17laktik asit bakterilerin dağılım sınırlaması incelemek için kullanılmıştır. Mikropsuz Napa lahanalar da fillosferde bireysel veya çift-bilge büyüme test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Kırmızı, yeşil ve Napa: steril sebze özü yapmak için yöntemler lahana üç farklı çeşitleri için test edilmiştir. Bu SVE’lerin her biri güvenilir bir büyüme ortamı olarak hareket eder; aşı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma USDA-NIFA hibesi ile desteklenmiştir: 2017-67013-26520. Tracy Debenport ve Claire Fogan teknik destek sağladı ve Ruby Ye ve Casey Cosetta bu el yazmasının erken sürümleri hakkında yararlı yorumlar sağlar.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
