Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Summary

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Abstract

Las endonucleasas diseñadas a medida, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas9 guiadas por ARN, permiten una edición eficiente del genoma en células de mamíferos. Aquí describimos procedimientos detallados para editar sin problemas el genoma del locus del factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4α) como ejemplo en células madre pluripotentes humanas. Combinando un plásmido donante basado en piggybac y el mutante de nickasa CRISPR-Cas9 en una selección genética de dos pasos, demostramos una orientación correcta y eficiente del locus HNF4α.

Introduction

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) representan una fuente ilimitada de células somáticas para la investigación o la clínica¹. La orientación génica en las hPSC ofrece un método poderoso para estudiar la función de los genes durante la especificación celular y para comprender los mecanismos de la enfermedad. Aunque existen métodos eficientes de edición del genoma, la modificación de genes en hPSCs sigue siendo técnicamente un desafío. La focalización génica estándar por recombinación homóloga en hPSCs ocurre con baja frecuencia o incluso es indetectable en algunos genes 2, por lo que la segmentación génica estimulada por la ruptura de doble cadena del ADN (DSB) (denominada edición génica) es necesaria en estas células ^2,3. Además, la transfección de hPSCs y la posterior clonación unicelular no es muy eficiente, aunque la apoptosis asociada a una sola célula puede reducirse mediante el uso del inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK)⁴. Finalmente, las posibles mutaciones en el objetivo y fuera del objetivo en el gen de interés también pueden ser problemáticas. Por lo tanto, un protocolo confiable es esencial para realizar cambios genéticos personalizados en las hPSC.

La tecnología CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) guiadas por ARN son ahora una herramienta bien establecida en la edición de genes. El ARN CRISPR transcrito (crRNA) y un ARN transactivador (tracrRNA) forman el ARN guía único (sgRNA), que se integra con la proteína Cas9 permitiendo la escisión específica del gen⁵. El sistema CRISPR/Cas9 es programable, cambiando una secuencia guía de 20 pb del sgRNA, lo que significa que se puede editar casi cualquier locus que cumpla con el requisito del motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Sin embargo, el tipo salvaje Cas9 puede tolerar algunos desajustes entre su secuencia guía y un objetivo de ADN, lo que podría causar efectos no deseados fuera del objetivo. Para mejorar su especificidad, se ha desarrollado un mutante de nickasa (Cas9n). Una mutación Cas9n que contiene D10A o N863A solo posee un dominio nucleasa funcional y, como resultado, solo puede cortar ADN en una hebra. Un par de Cas9n adecuadamente espaciados y orientados pueden inducir efectivamente ADN DSB y los efectos fuera del objetivo se reducen drásticamente⁶. Para garantizar una modificación eficiente de Cas9n, se ha demostrado que dos Cas9n-sgRNA idealmente deben colocarse con un desplazamiento de -4 a 20 pb y siempre crear un voladizo de 5′⁶.

El DSB inducido por Cas9(n)-sgRNA puede utilizarse para la edición del genoma en hPSCs ^7,8. Puede crear un knockout de genes a través de la reparación de unión de extremos no homólogos, o introducir la modificación de genes a través de la reparación dirigida por homología (HDR) si hay una plantilla de ADN de donante. El protocolo descrito aquí utiliza un plásmido donante basado en transposón piggyBac (o vector objetivo) para HDR, en el que un marcador de resistencia a los medicamentos está flanqueado por las repeticiones invertidas del transposón. La ventaja de este enfoque incluye un cribado eficiente y una edición de genes sin fisuras, como lo demostraron por primera vez Yusa et ^al.9,10. El casete de selección de fármacos permite el enriquecimiento de las células con el vector integrado, que posteriormente son tamizadas por PCR de unión para identificar las derivadas por HDR. Además, el casete de selección de fármacos se puede colocar para reemplazar las secuencias objetivo para la escisión de Cas9 (n), de modo que no se produzca más rotura del ADN después de HDR, eliminando así las mutaciones objetivo “en” resultantes de la re-escisión de Cas9 (n). Además, al explotar la escisión precisa catalizada por la transposasa piggyBac, el marcador de selección se extirpa del genoma sin dejar cicatriz. Sólo queda la secuencia endógena original de TTAA para la inserción de piggyBac después de la eliminación del marcador de selección de fármacos⁹. Incluso si los sitios TTAA tienen que ser creados mediante la introducción de sustituciones, las posibilidades de perturbar los elementos regulatorios se reducen en comparación con otros métodos¹⁰.

Aquí describimos procedimientos detallados para implementar la edición perfecta del genoma en hPSC. Combinando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa CRISPR-Cas9 en una selección genética de dos pasos, introdujimos dos mutaciones puntuales predeterminadas en el gen¹¹ del factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4α). Este enfoque es confiable y eficiente, y ha permitido analizar en profundidad el importante papel desempeñado por HNF4α en la especificación del endodermo y hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas¹¹.

Protocol

1. Diseño y construcción de plásmidos de expresión CRISPR/Cas9n-sgRNA Busque secuencias de guía de 20 pb directamente aguas arriba de cualquier 5′-NGG cerca del sitio que se va a modificar. Se necesita un par de ARN de guía única (sgRNAs) cuando se usa la nickasa Cas9 (Cas9n) de Streptococcus pyogenes . El par de sgRNAs debe ser capaz de generar voladizos de 5′ al cortar con un desplazamiento de -4 a 20 pb6. Ordene los oligos necesarios y el vector pSpCas9n-2A-puro. Clone sgRNA en el vector pSpCas9n para la coexpresión con Cas9n siguiendo el protocolo publicado12. 2. Diseño y construcción de un vector de focalización basado en piggybac Descargue la secuencia del gen diana y busque un sitio TTAA cerca del sitio que se va a modificar.NOTA: La distancia entre el sitio TTAA y el sitio que se va a modificar debe ser lo más pequeña posible. Si dentro de la secuencia codificante y no hay un sitio TTAA presente dentro de la distancia de 100 pb, es necesario introducir uno haciendo sustituciones de nucleótidos sinónimos. Diseñar brazos de homología (HA) e incorporar las mutaciones puntuales deseadas en los HA. La longitud óptima de las HA debe ser de alrededor de 500 – 1200 pb.NOTA: Se recomienda introducir sustituciones de nucleótidos sinónimos para mutar la secuencia PAM con el fin de evitar la posible escisión de Cas9n. Construir el vector de focalización final siguiendo un protocolo establecido10.NOTA: En el vector de focalización utilizado aquí, un casete de selección puro-deltaTK impulsado por un promotor PGK está flanqueado por repeticiones invertidas de transposón. 3. Edición genética de células madre pluripotentes humanas Mantener células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2 en superficies recombinantes recubiertas de laminina 521 (5 μg/mL) en medio mTeSR113. Las células deben alcanzar una confluencia del 70-85% después de 72 horas siguiendo una proporción de división de 1:3.NOTA: Si está presente, retire las células espontáneamente diferenciadas antes del cambio diario del medio aspirándolas suavemente. El día de la transfección, cubrir los pocillos suficientes de una placa de 24 pocillos con 300 μL de la solución de laminina 521 (5 μg/ml) a 37 °C durante al menos 2 h. Retire la solución de recubrimiento suavemente y agregue 300 μL de medio mTeSR1 fresco suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM a cada pocillo, y luego vuelva a colocar la placa en la incubadora para recibir células.NOTA: No permita que las placas se sequen en ningún momento cuando se retire la solución de recubrimiento de laminina. Retire las hPSC de stock de la incubadora, retire el medio gastado y luego lave las células una vez usando 1 ml de 1x DPBS estéril. Añadir 1 ml de reactivo de disociación celular suave a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar a 37 °C durante 6-8 min para disociar las células.NOTA: Golpee suavemente la placa y verifique si las células pueden desprenderse fácilmente para decidir si la digestión es lo suficientemente larga. Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta P1000 para levantar todas las hPSC. Terminar la disociación añadiendo 2 ml de medio mTeSR1 fresco suplementado con 10 μM inhibidor de ROCK (Y-27632) a la suspensión celular. Mezclar bien y transferir la suspensión de una sola celda a un tubo de 50 ml, y centrifugar a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspenda bien las células en medio mTeSR1 fresco de 2 ml suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM. Contar las células viables usando un hemocitómetro. Use Trypan Blue para teñir y excluir las células muertas. Transfiera 8 x 105 a 1 x 106 células vivas a un tubo de 1,5 ml para cada reacción de nucleofección y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante. Mezclar 3 μg de plásmidos de expresión de Cas9n-sgRNA pareados y 5 μg de plásmido vectorial objetivo en 100 μL de solución/suplemento de nucleofección mixta del kit de nucleofección de células madre humanas. Utilice el plásmido de control GFP del kit y prepare también una mezcla de plásmidos de control GFP.NOTA: Es importante hacer una maxi-preparación de todos los plásmidos para reducir la contaminación por endotoxinas antes de la nucleofección. La concentración de los plásmidos debe ser de aproximadamente 1 μg/μL. Utilice la mezcla de ADN (volumen ~ 111 μL) para resuspender las células preparadas y transferirlas a una cubeta de electroporación (provista del kit de nucleofección), evitando cualquier burbuja. Electroporar las células utilizando el dispositivo de nucleofección seleccionando las condiciones optimizadas para las células madre pluripotentes humanas.NOTA: Si se utiliza el kit de nucleofección para células madre pluripotentes humanas por primera vez, es necesario probar el programa de electroporación y elegir el más eficiente. Añadir inmediatamente 500 μL de medio mTeSR1 fresco y caliente a 37 °C suplementado con inhibidor ROCK de 10 μM a las células electroporadas. Transfiera la mezcla a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos preparada a partir de los pasos 3.2 y 3.3. Vuelva a colocar rápidamente la placa en la incubadora deCO2 a 37 °C/5% y permita que las células se recuperen. 12-16 h más tarde, cambie el medio de mantenimiento de la celda. Si las células establecieron contacto célula-célula, retirar el inhibidor de ROCK, si no, continuar complementando el medio con el inhibidor. Entre 24-48 h, comprobar la eficacia de la nucleofección examinando la expresión de GFP en las células de control. Las células GFP positivas deben ser al menos 30 por ciento. 48 h después de la nucleofección, comience a seleccionar células complementando el medio mTeSR1 con 1 μg/ml de puromicina. 72 h después de la nucleofección, complementar el medio mTeSR1 con 0,5 μg/ml de puromicina. Si la confluencia celular es inferior al 30%, también complemente el medio con un inhibidor ROCK de 10 μM. 4-6 días después de la nucleofección, pasar las células resistentes a la puromicina a placas de 10-15 x 96 pocillos a la concentración de 0,8 células/pocillo.NOTA: Es esencial complementar el medio con un inhibidor ROCK de 10 μM y una puromicina de 0,5 μg/ml. Mantener esas células a 37 °C/10% de CO2 durante 10-12 días para formar colonias derivadas de células individuales. Rellene el medio una vez 7 días después de la siembra.NOTA: El aumento del nivel deCO2 ayuda a las hPSC individuales a formar colonias según nuestra experiencia. Marque los pocillos que contienen una sola colonia y reemplácelo con medio mTeSR1 fresco que contenga 0,5 μg/ml de puromicina pero sin inhibidor de ROCK.NOTA: A partir de este momento, las células se cultivarán por debajo de 37 °C / 5% deCO2. Dos días después, cambie el medio por pozos que contengan colonias indiferenciadas. Complementar el medio con 10 μM inhibidor de ROCK y 0,5 μg/ml de puromicina.NOTA: En algunos pozos, las células pueden haberse diferenciado y necesitar ser desechadas. Use puntas de pipeta P2 para raspar las colonias suavemente. Transfiera la suspensión celular derivada de una colonia a 2 nuevos pocillos en placas separadas de 96 pocillos, y use uno para genotipado y otro para mantenimiento.NOTA: Es importante mantener cuidadosamente las colonias y mantener el nivel de diferenciación espontánea al mínimo. Tome la placa que contiene células para genotipar una vez que la confluencia en la mayoría de los pozos alcanzó el 50% o más. Volque el medio gastado y luego lave las celdas una vez con DPBS. Lise las células en pozo usando tampón de lisis de Bradley y aísle el ADN genómico de cada pocillo en la placa siguiendo el protocolo asociado (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate). Utilizar un método de PCR de unión de tres cebadores para genotipar los brazos homólogos izquierdo y derecho de forma independiente10.NOTA: En la Figura 2 se presenta un esquema que muestra el método de PCR. Envíe los productos de PCR de unión para ambos brazos de homología de 4-5 colonias para la secuenciación de Sanger y obtenga las secuencias.NOTA: El resultado de la secuenciación de 2 colonias establecidas se muestra en la Figura 3A. Mantenga las colonias con el genotipo correcto y descarte el resto. Expandir las colonias correctas bajo selección continua de puromicina y congelarlas en el paso más temprano posible. 4. Eliminación del transposón de células madre pluripotentes humanas dirigidas Mantener una colonia con genotipo correcto por debajo de 0,5 μg/ml de selección de puromicina. Nucleofect 8 x 10 5 a 1 x 106 células con5 μg de transposasa hiperactiva (pCMV-hyPBasa) como se describió anteriormente (Sección 3, pasos 3.4-3.18). Realizar una nucleofección de control GFP en paralelo.NOTA: La puromicina debe eliminarse del medio mTeSR1 inmediatamente después de nucleofecar estas células. Cultivar y detectar células con el casete de selección puro-deltaTK eliminado siguiendo los procedimientos publicados10.NOTA: Es importante seguir cuidadosamente los procedimientos originales. FIAU, o 1-(2-desoxi-2-fluoro-β-d-arabinofuranosil)-5-yodouracilo), se utilizó como un análogo de timidina para la selección negativa basada en la timidina quinasa derivada del virus del herpes simple (HSV-tk). Secuencie la región modificada para confirmar la eliminación del transposón.NOTA: El resultado de la secuenciación de 3 colonias establecidas se muestra en la Figura 3B. Mantenga colonias con el genotipo correcto y amplíe para su uso posterior. Realizar la caracterización de los marcadores de pluripotencia en las colonias elegidas antes de utilizarlos para su posterior análisis.NOTA: La caracterización de dos colonias establecidas se muestra en la Figura 4.

Representative Results

Estrategia de knock-in basada en vectoresEl gen alfa del factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4α) se eligió para la edición dirigida del genoma para introducir dos mutaciones puntuales en el exón 8. Se diseñó un par de Cas9n-sgRNA con un desplazamiento de 11 pb cerca del sitio a modificar. El vector de orientación basado en piggyBac funcionó como la plantilla de reparación dirigida por homología para introducir las mutaciones puntuales deseadas. Un 967 pb 5′-HA y un 1142 pb 3′-HA incorporando sustituciones de nucleótidos sinónimos o las mutaciones puntuales deseadas fueron amplificados y clonados en el vector objetivo final. El sitio de inserción de piggyBac estaba a 16 pb y 22 pb de distancia de las dos mutaciones puntuales deseadas. Las colonias que contenían el casete de selección puro-deltaTK fueron seleccionadas con puromicina en la primera ronda. Una vez que el casete de selección se eliminó mediante escisión de transposasa en la segunda ronda, el sitio objetivo se modificó sin problemas con solo las mutaciones puntuales deseadas incorporadas en el gen (Figura 1). Edición genética en células madre pluripotentes humanasPara detectar células correctamente dirigidas, se utilizó un método de PCR basado en tres cebadores para el genotipado (Figura 2). Se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar los resultados de la PCR (Figura 3A). Después de la retirada del casete de selección, la región modificada se secuenció nuevamente para confirmar la introducción correcta de las mutaciones puntuales deseadas (Figura 3B). Establecimiento de colonias y caracterización de células madre pluripotentes humanas editadasLas colonias con el genotipo correcto fueron seleccionadas y expandidas según fuera necesario. Las colonias establecidas deben caracterizarse antes de ser utilizadas para un análisis posterior. Las células editadas poseen la misma morfología que las células parentales (Figura 4A). También expresan marcadores representativos de células madre pluripotentes humanas, incluidos los factores de transcripción NANOG y OCT4 (Figura 4 B), así como los marcadores de superficie celular SSEA4 y TRA-1-60 (Figura 4C). Figura 1: Estrategia de knock-in basada en vectores11. Se utilizaron un par de plásmidos de expresión de Cas9n-sgRNA para inducir la ruptura de la doble cadena del ADN en el exón 8 del gen HNF4α. Se utilizó un vector de focalización con un casete de selección para introducir mutaciones puntuales predeterminadas localizadas a 16 pb y 22 pb de distancia. Este casete de selección estaba contenido dentro del transposón piggyBac , que consiste en un marcador de selección positivo-negativo (puro-deltaTK) impulsado por un promotor constitutivamente activo (PGK). A través de la vía de reparación dirigida por homología, las células objetivo incorporaron el casete de selección. La escisión de transposones mediada por transposasa da como resultado una modificación perfecta con solo las mutaciones puntuales presentes. La cruz roja indica la ubicación de las mutaciones puntuales deseadas. HA = brazo de homología; PB = piggyBac; PM = mutación puntual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Método de PCR basado en tres cebadores. Para detectar las células dirigidas a genes, se utilizó genotipado basado en PCR. Se utilizaron tres cebadores, LA-F1, -R1 y -R2 para amplificar la región del brazo homólogo izquierdo. Independientemente, RA-F1, -F2 y -R1 se utilizaron para amplificar la región del brazo de homología derecha. Según el resultado de la electroforesis en gel, se distinguieron las células no diana y las células heterocigotas y homocigotas entre sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Resultados de secuenciación de células modificadas genéticamente11. Se secuenciaron productos de PCR de dos clones y se confirmó la inserción correcta del casete de selección en el locus objetivo (A). Las repeticiones terminales invertidas (ITR) piggyBac de 5′ y 3′ estaban flanqueadas por las repeticiones directas TTAA. Tres clones fueron secuenciados después de la escisión de transposones (B). Se utilizó un par de Cas9n-sgRNA con un desplazamiento de 11 pb para introducir la ruptura de doble cadena del ADN. Se introdujeron dos mutaciones puntuales predeterminadas (A a G y A a C) en el gen. Se introdujo una mutación sinónimo para mutar el motivo adyacente al protoespaciador (PAM), y otra para crear el sitio TTAA necesario para la escisión de piggyBac . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Caracterización de células madre pluripotentes humanas editadas. Morfología de dos líneas celulares editadas y las células parentales (A), barra de escala = 100 μm. La expresión de los marcadores de células madre pluripotentes NANOG y OCT4 se examinó mediante inmunotinción (B, barra de escala = 50 μm), además de SSEA4 y TRA-1-60 mediante citometría de flujo (C) en dos líneas celulares modificadas y en las células parentales. Se utilizó IgG como control negativo. DAPI se utilizó para teñir el núcleo. Los porcentajes se calcularon como el promedio de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo descrito en este documento se puede utilizar para introducir mutaciones puntuales predeterminadas en un locus endógeno en hPSCs. La combinación de un vector de focalización basado en piggyBac y plásmidos de expresión CRISPR/Cas9n pareados demostró ser fiable y eficiente¹¹. Después de la edición del gen HNF4α, 12 de los 43 clones analizados se dirigieron correctamente según lo determinado por la detección de PCR de unión. Específicamente, la eficiencia de la focalización bialélica fue de aproximadamente el 21% (9/43) y la eficiencia de la focalización monoalélica fue de alrededor del 7% (3/43).

Después de los experimentos de focalización, es crucial mantener la selección de puromicina para mantener el locus objetivo accesible a la transposasa piggyBac durante la primera ronda de detección. Esto minimizará el silenciamiento del casete de selección puro-deltaTK impulsado por el promotor PGK y reducirá el fondo en la segunda ronda de selección¹⁰. Un informe reciente mostró que el promotor CAG es más resistente al silenciamiento que el promotor PGK en hPSCs¹⁴. Por lo tanto, cambiar el promotor para el casete de selección podría mejorar este sistema en el futuro. También es importante comparar el número de colonias resistentes de células transfectadas con hyPBasa y GFP. Tras la eliminación exitosa del transposón, debería haber más colonias sobrevivientes de las células transfectadas con hyPBasa que GFP. Además del análisis por PCR de la escisión de transposones, se requiere la secuenciación directa de la región modificada para confirmar la fidelidad de la escisión.

Basado en^{la estrategia de} vector de focalización basada en transposones piggyBac de Yusa 9,10^, los procedimientos detallados anteriormente se centraron en mejorar la nucleofección de hPSCs y la eficiencia de clonación de células individuales. La densidad de siembra celular se optimizó para reducir la probabilidad de formación de colonias heterogéneas. También empleamos un cultivo de 10-12 días por debajo del 10% de_CO2 para mejorar la producción de colonias para el cribado de genotipos. En nuestra experiencia, se podrían obtener alrededor de 20 colonias de cada placa de 96 pocillos. Aunque este paso puede llevar más tiempo que otros métodos, es confiable y altamente eficiente.

Según la necesidad, los vectores dirigidos pueden diseñarse para introducir o corregir mutaciones puntuales, para crear líneas celulares reporteras, así como para la expresión génica knockout. En conclusión, la combinación del sistema CRISPR/Cas9(n) y un vector objetivo es una forma eficiente de administrar diferentes tipos de hPSC modificadas genéticamente.

Materials

Anti-Human SSEA4 PE	eBioscience	12-8843-42
Anti-Human TRA-1-60 PE	eBioscience	11-0159-42
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
DPBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040133
FIAU	Moravek	M251
Gentle cell dissociation reagent	Stem Cell Technologies	07174
H9 human embryonic stem cells	WiCell	WA09
Human NANOG antibody	R&D systems	AF1997
Human OCT4 antibody	Abcam	AB19857
Human stem cell Nucleofector kit 1	Lonza	VPH-5012
Mouse IgG3 isotype control PE	eBioscience	12-4742-41
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	85850
Nucleofector 2b device	Lonza	AAB-1001
pCMV-hyPBase	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)	Addgene	PX462
Puromycin dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A11138-03
QIAprep spin maxiprep kit	Qiagen	12162
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27106
Recombinant laminin 521	BioLamina	LN521
Trypan blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Y-27632(Dihydrochloride)	Millipore	SCM075