זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ
Summary
סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.
Abstract
cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1 של מחזור התא, להיות resorbed לפני המיטוזה. ניתן לדמיין cilia הראשי עם שיטות מתוחכמות מאוד, כולל מיקרוסקופאלקטרונים שידור, הדמיה 3D, או שימוש בתוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי. עם זאת, כתמי חיסון של cilia הראשי יש צורך לבצע שיטות אלה. פרסום זה מתאר פרוטוקול לזיהוי קל של cilia הראשי במבחנה על ידי הכתמת אצטילאט אלפא טובולין (אקסואנם) וגמא טובולין (גוף בזל). פרוטוקול כתמים חיסוני זה הוא פשוט יחסית ומביא לתמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ארבעה קווי תאים (C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) המבטאים cilia ראשי תוקנו, immunostained, ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.
Introduction
cilia העיקריים הם חושיים, בודדים, קרום כבול, מבנים לא מוזגים הקשורים צנטריול אמו של התא. cilia העיקרי נמצאים על רוב תאי החוליות למעט תאי דם אדומים, adipocytes1, ו hepatocytes2. cilia הראשי נוצרים כמו אקסואנם מוארך מורכב על ידי microtubules, שהרכיב העיקרי שלהם הוא α-tubulin. האקסואנם גדל מגוף הבסאלי, המוערך מ-0.0. אורכו של cilia הראשי משתנה בין 2-10 μm; עם זאת, ממדיו יכולים להשתנות במהלך גליצילציה, רעב, היפוקסיה, מתח ציטוקוקס, או לאחר חשיפה לקרינהמיוננת 3,4,,5,6,7. בדרך כלל, תאים יש רק סיליום ראשוני אחד, אשר מעורב morphogenesis ותא איתות מסלולים חשובים להתפשטות תאיםובידול 8,9.
cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1, וororbed לפני הזנת מיטוזה בתהליך המשויך deacetylation טובלין בתיווך HDAC6 (histone deacetylase 6)10. הרגע המדויק של ספיגת cilia הראשי תלוי סוג התא ואת הביטוי של גנים המעורבים ישירות בתהליך זה, כגון אורורה A, Plk1, TcTex-111,,12,13. בהתאם לסוג התא, cilia הראשי לבטא סוגים שונים של קולטנים, ערוצי יון, ומסלולי איתות פעילים. אלה כוללים את קולטני האיתות החשובים ביותר המשפיעים על התפשטות והישרדות, EGFR, PDGFR ו- FGFR. כלולים גם כמה מסלולי איתות שעשויים להשפיע על הפונקציה של איברים אחד או יותר, כולל קיפוד, חריץ, ו Wnt. הודות קולטנים אלה ומסלולי איתות, cilia הראשי גם לבצע פונקציה chemosensory. פונקציה זו מאפשרת cilia הראשי לזהות ליגנדים ספציפיים עבור חריץ, הורמונים, וחומרים פעילים ביולוגית כגון סרוטונין או somatostatin. פונקציות ספציפיות אחרות המוצגות על ידי cilia ראשוני של אורכים שונים כוללים תגובה לשינויים בטמפרטורה, כוח המשיכה, osmolality14.
Cilia הראשי ניתן לדמיין באמצעות שיטות שונות, כגון הדמיה חיה, מיקרוסקופאלקטרון שידור, הדמיה 3D, או על ידי תוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי5,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה הן מאוד מיוחדים ומתמשך מחקר צריך בסיסי, מהיר, ושיטות קלות להכתים cilia הראשי בכל שלב של המחקר. מתואר היא שיטה קלה ושימושית לזיהוי cilia הראשי בתאים תרבותיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר מחברים תיארו שיטות מגוונות לזיהוי סיליה ראשית, לעתים גם מתארים שיטות קיבעון שונות שיכולות להשפיעעל הגילוי שלהם 6,20,21,22. ללא קשר, קשה למצוא פרוטוקול מלא וישיר לזיהוי. הזמינות המוכנה של שיטה כזו תהיה ללא ספק של סיוע רב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה של הרפובליקה הצ’כית – תוכנית פיתוח ארגונית ארוכת טווח היבטים רפואיים של נשק להשמדה המונית של הפקולטה למדעי הבריאות הצבאית, אוניברסיטת ההגנה; משרד החינוך, הנוער והספורט, צ’כיה (פרויקט מחקר ספציפי מס’: SV/ FVZ201703) ו-PROGRES Q40/06. תודה גם לדניאל דיאז על עזרתו האדיב בתיקון בשפה האנגלית.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
