建立猪外维沃角膜模型研究药物治疗细菌性角膜炎
1Sheffield Collaboratorium for Antimicrobial Resistance and Biofilms (SCARAB),University of Sheffield, 2Department of Chemical and Biological Engineering,University of Sheffield, 3Hyderabad Eye Research Foundation,L V Prasad Eye Institute, 4Health Economics and Decision Science, School of Health and Related Research,University of Sheffield, 5Department of Molecular Biology and Biotechnology,University of Sheffield, 6Department of Materials Science and Engineering,University of Sheffield, 7Department of Infection, Immunity and Cardiovascular Disease,University of Sheffield
Summary
本文描述了建立细菌性角膜炎前活体猪模型的分步协议。 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨 被用作原型生物体。这种创新模式模仿体内感染，因为细菌的增殖取决于细菌破坏角膜组织的能力。
Abstract
在开发新型抗菌药物时，动物试验的成功取决于从体外试验到体内动物感染的抗菌效果的准确推断。现有的体外测试通常高估了抗菌效能，因为主机组织作为扩散屏障的存在没有被考虑在内。为了克服这一瓶颈，我们开发了一种细菌性角膜炎的前活体猪角膜模型，使用 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨 作为原型生物体。本文描述了猪角膜的准备和建立感染的协议。定制玻璃模具可直接设置角膜用于感染研究。该模型模拟体内感染，因为细菌增殖取决于细菌损害角膜组织的能力。感染的建立被证实为通过可行的板数评估的殖民地形成单位数量的增加。结果表明，使用此处描述的方法，可以在前体角膜中以高度可重复的方式建立感染。该模型可以在未来扩展，以模拟角膜炎引起的微生物以外的 P.阿鲁吉诺萨。该模型的最终目标是研究抗菌化疗对细菌感染进展的影响，在更能代表体内感染的情况下。通过这样做，这里描述的模型将减少动物用于测试，提高临床试验的成功率，并最终使新型抗菌素快速翻译到诊所。
Introduction
角膜感染是致盲的重要原因，在低收入和中等收入国家流行。这种疾病的病因因地区而异，但细菌占这些病例的绝大多数。伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨是导致一种快速进步的疾病的重要病原体。在许多情况下，患者留下频闪疤痕，不规则的散光，需要移植或在最坏的情况下，失去一只眼睛1，2。
由 P.aeruginosa 引起的细菌性角膜炎是一种难以治疗的眼睛感染，特别是由于抗微生物药物耐药菌 株的日益出现。在过去十年中，很明显，测试和开发新的治疗角膜感染的方法，一般来说，特别是那些由 伪多莫纳斯 sp.引起的，对于对抗抗生素耐药性3的当前趋势至关重要。
为了测试角膜感染新疗法的疗效，传统的体外微生物方法是一种糟糕的替代方法，因为在实验室培养期间和在体内感染期间细菌生理学的差异，以及由于缺乏宿主接口4，5。然而，体内动物模型昂贵、耗时，只能提供少量的复制品，并引起人们对动物福利的担忧。
在本文中，我们展示了一个简单和可重复的角膜炎体外猪模型，可用于测试急性和慢性感染的各种治疗方法。我们已经使用 P.aeruginosa 进行这个实验，但模型也与其他细菌，以及生物体，如真菌和酵母，导致角膜炎运作良好。
Protocol
白化病实验室的兔子被牺牲在实验室里，根据内政部批准的协议进行其他计划中的实验工作。这些研究不需要眼睛进行实验性使用，因此它们用于此协议。 1. 绝育 关键步骤：在蒸馏水中浸泡 1 小时（v/v/v） Distel 溶液，用刷子清洁，用自来水冲洗，并在 185 °C 的烤箱中消毒，至少 2 小时，对所有钳子和剪刀进行消毒。 通过在 121 °C 下自动拍击 15 分钟或根据制?…
Representative Results
玻璃模具的设计是一个创新和原创的想法，其使用使我们能够建立模型在一致的方式与最小的/没有污染的问题。这些模具是由谢菲尔德大学的玻璃鼓风机根据设计（图1A）制备的。实验设置保持角膜的凸形，并将细菌保存在发生感染的上皮上部（图1B）上。 猪角膜通常在中等的几天后膨胀。这是正常的，我们发现角膜之间没有显著…
Discussion
使用外体猪角膜开发这种角膜模型的主要驱动力是为开发新型抗菌素的研究人员提供具有代表性的体外模型，以更准确地确定前脑阶段的抗菌功效。这将为参与开发新的抗菌药物的研究人员提供在临床前阶段对药物设计和配方的更大控制，提高临床试验的成功率，通过有针对性的研究减少动物的使用，并加快将新的抗菌素转化为临床。
多项研究已调查了感染各种动物的外生?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢切斯特菲尔德的艾略特·阿巴特奥提供猪眼。玻璃戒指是谢菲尔德大学化学系的玻璃鼓风机丹·杰克逊根据我们的设计制作的。作者要感谢医学研究理事会（MR/S004688/1）的资助。作者还要感谢沙纳利·迪克韦拉夫人在角膜制备方面的技术帮助。作者要感谢乔纳森·埃默里先生在图片格式化方面所起的帮助。
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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Citer Cet Article
Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).