Presentert her er en protokoll for den primære avklaringen av CHO cellekultur ved hjelp av en akustisk separator. Denne protokollen kan brukes til den primære avklaringen av shake kolbekulturer eller bioreaktorhøster og har potensiell anvendelse for kontinuerlig avklaring av celleblødningsmaterialet under perfusjonsbioreaktoroperasjoner.
Primær avklaring er et viktig skritt i en bioproduksjonsprosess for første fjerning av celler fra terapeutiske produkter i høstet cellekulturvæske. Mens tradisjonelle metoder som sentrifugering eller filtrering er allment implementert for cellefjerning, har utstyret for disse prosessene store fotavtrykk, og drift kan innebære forurensningsrisiko og filterfouling. I tillegg er tradisjonelle metoder kanskje ikke ideelle for kontinuerlige bioprosesseringsordninger for primær avklaring. Dermed ble en alternativ applikasjon ved hjelp av akustiske (lyd) bølger undersøkt for å kontinuerlig skille celler fra cellekulturvæsken. Presentert i denne studien er en detaljert protokoll for bruk av en benkskala akustisk bølgeseparator (AWS) for den primære separasjonen av kulturvæske som inneholder et monoklonalt IgG1-antistoff fra en CHO-cellebioreaktorhøst. Representative data presenteres fra AWS og viser hvordan man oppnår effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting. Til slutt diskuteres potensielle applikasjoner for AWS i kontinuerlig bioprosessering. Samlet sett gir denne studien en praktisk og generell protokoll for implementering av AWS i primær avklaring for CHO-cellekulturer og beskriver videre applikasjonspotensialet i kontinuerlig bioprosessering.
Et kritisk skritt i en bioproduksjonsprosess som involverer utskilte terapeutiske proteiner er fjerning av biomasse fra høstet cellekulturvæske (HCCF). Tradisjonelt har bioproduserte stoffer vedtatt sentrifugering etterfulgt av dybdefiltrering som deres primære avklaringsmetoder i produksjon av monoklonale antistoffer1. Sentrifugering kan imidlertid føre til høy skjærspenning på cellene, noe som resulterer i økt cellulært rusk i HCCF. Dette kan potensielt føre til filterfouling under filtrering og resultere i ekstra forurensninger postfiltrering som senere kan redusere nedstrøms kromatografi effektivitet1,2,3. Videre kan tilpasningen av sentrifugene for en bestemt prosess være kostbar og kan kreve ytterligere tilkoblinger til rene systemer på stedet og sterilisering på stedet som også kan være en begrensende faktor for skalerbarhet. Bruken av dybdefiltre kan kompensere for begrensningene i sentrifugeringen og også dra nytte av engangsteknologi4. Dybdefiltre brukes imidlertid først og fremst som sekundær avklaring fordi de ikke tåler høycellet kulturtetthet5. Alternativt har tangentiell strømningsfiltrering (TFF) celleretensjonsenheter blitt brukt for å redusere skjærspenning, men kan oppleve utfordringer som membranpolarisering og dårlig høstutbytte6. Ovennevnte problemer som oppstår ved bruk av sentrifugering pluss dybdefiltrering eller TFF skaper en mulighet for forbedring av den primære avklaringsprosessen til HCCF.
Akustisk separasjon ble introdusert som en teknologi som kan brukes til høsting av utskilte proteiner fra cellekulturer med proteinprodukter av høy kvalitet7,8. Akustisk separasjon oppnås gjennom forplantning og refleksjon av flerdimensjonale stående bølger som samhandler med suspenderte væsker og beholdte partikler9,10. Disse partiklene opplever tre krefter: væskedrag, tyngdekraft og akustisk stråling. Når hver av kreftene er like imot hverandre, når likevekt, blir partiklene suspendert og fanget i ultralyd stående bølge10. I en cellekulturfjæring holdes celler i dette trykknodeplanet av stående bølger, noden vokser når cellene samles, og til slutt faller disse klyngene av cellulære noder fra gravitasjonskraften9. Disse sedimenterte cellene fjernes deretter fra mediet, noe som gjør at de avklarte mediene kan pumpes ut for videre nedstrøms prosessering. Utnyttelsen av ultralydbølger som separasjonsmetode har begynt å oversette til biologiske applikasjoner som spenner fra separasjon av lipidpartikler og røde blodlegemer11 til pattedyrperfusjonscellekultur12. Med sine relative evner til å redusere kostnader, arbeidskraft og cellulært stress ved å unngå sentrifugering, dybdefiltrering eller TFF, utforsker bioproduserte stoffer de potensielle bruksområdene ved bruk av akustisk separasjon.
Denne studien gir en generell protokoll for å drive en stasjonær akustisk bølgeseparator (AWS) for avklaring av CHO-cellekultur, presenterer representative data og demonstrerer hvordan man oppnår effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting.
Beskrevet er en trinnvis protokoll for implementering av en benk-skala AWS i primær avklaring av en modell monoklonal antistoff fra HCCF av en CHO celle linje. Som vist i de representative resultatene, resulterte bruken av AWS i primær avklaring i effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting. Videre tillater det lave nivået av vedlikeholds- og driftskrav og oppskaleringsevne bredere applikasjonspotensial i primær avklaring.
Det er viktig at de representative resultatene antyder at matepumpehastigheten er kritisk for separasjonen av cellene. I tillegg, på grunn av begrensninger i å oppdage høy celletetthet i turbiditetsmålingen, er arbeidscelletetthet en annen faktor å vurdere når du bruker et AWS-system. Fordi turbiditetssonden vil bli mettet når du kjører fôrmateriale med høy celletetthet, kan det være best å beregne celleseparasjonseffektivitet ved å måle celletettheten til fôrmaterialet og avklart cellekulturvæske offline. Med nøyaktig offline måling av avklaring, er en prosessstrategi som kan vurderes for å løse disse problemene å bruke flere kamre i serie. Selv om denne protokollen først og fremst er fokusert på å bruke et enkelt kammer, kan dette systemet operere tre ekstra kamre for sekvensiell avklaring av cellene som minimalt kan påvirke tilstanden til cellene og føre til høy produktgjenoppretting. I tillegg kan andre parametere, for eksempel strøm for AWS og strømningshastigheter for fjerning av celler, optimaliseres ytterligere for bestemte celletyper eller driftsmodus. Samlet sett anbefales en optimalisering av operasjonsparametrene og strategien ved hjelp av disse vurderingene før implementering av AWS.
Blant mange applikasjonspotensialer er bruken av AWS i kontinuerlig bioprosessering lovende. Fordi AWS kan erstatte sentrifugering og drastisk redusere filteroverflateområdet14, vil bruken av AWS muliggjøre en konstant strøm av cellefritt materiale for etterfølgende filtrerings- og kromatografiprosesser som er kompatible med kontinuerlig bioproduksjon. På grunn av denne kompatibiliteten og tilgjengeligheten av perfusjonsteknologi for høy celletetthet (f.eks. >50 x 106 celler/ml) og lengre kulturvarighet (f.eks. >14 dager), har AWS potensial til å utvikle en ny kontinuerlig celleblødningsstrategi i tillegg til den primære avklaringen.
I noen tilfeller fjernes opptil 30% av proteinterapeutisk produsert under steady-state-drift i celleblødningsmaterialet15,16. I tillegg, for at de fjernede monoklonale antistoffene skal samles med standard høstet materiale, må visse kvalitetsattributter oppfylles. Når disse spesifikasjonene ikke er oppfylt, kan resultatet bli en avvisning av materiale som kan påvirke produktutbyttet. For å kompensere for slikt produkttap kan en kontinuerlig avklaring av celleblødningsmateriale ved hjelp av AWS implementeres ved steady-state-tilstand under en langsiktig perfusjonsprosess17. Denne strategien kan redusere produkttapet i det utfallende materialet og utnytte mer av proteinet som produseres. I tillegg kan celler etter den kontinuerlige avklaringen ved hjelp av AWS potensielt legges tilbake i bioreaktoren hvis ønskelig for høyere celletetthet og produktivitet. Dermed kan kontinuerlig avklaring av celleblødningsmateriale med AWS gi mulighet til å øke utbyttet og/eller redusere sekundært filteroverflateareal i en gitt prosess.
Oppsummert er nytten av AWS ikke begrenset til enkel primær avklaring, men kan ha nytte for applikasjoner i kontinuerlig bioprosessering som kan forbedre produksjonshastigheten og driftsfleksibilitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Nilou Sarah Arden og Zhong Zhao for deres konstruktive gjennomgang av dette manuskriptet. Forfatterne vil også takke Lindsey Brown for viktige innspill i dette prosjektet. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbeidet ble levert av CDER Critical Path Program (CA #1-13) og CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dette prosjektet ble delvis støttet av Internship/Research Participation Program ved Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, administrert av Oak Ridge Institute for Science and Education gjennom en interagency-avtale mellom det amerikanske energidepartementet og FDA.
Denne publikasjonen gjenspeiler forfatterens synspunkter og bør ikke tolkes til å representere FDAs synspunkter eller retningslinjer.
Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |