फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में स्यूडोमोनास संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन
Summary
यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए कैसे सिगरेट धुआं निकालने फेफड़ों एपिथेलियल कोशिकाओं में जीवाणु उपनिवेशीकरण को प्रभावित करता है ।
Abstract
सिगरेट धूम्रपान फेफड़ों के एम्फिसिमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) के लिए प्रमुख एटियोलॉजिकल कारण है। सिगरेट पीने से श्वसन प्रणाली में बैक्टीरियल संक्रमण की संवेदनशीलता को भी बढ़ावा देता है। हालांकि, मानव फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट पीने के प्रभाव का अभी तक अच्छी तरह से अध्ययन किया जाना है । यहां वर्णित सिगरेट धूम्रपान अर्क (सीएसई), सीएसई के साथ मानव फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं के उपचार, और बैक्टीरियल संक्रमण और संक्रमण निर्धारण की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। सीएसई को पारंपरिक विधि से तैयार किया गया था। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को 3 घंटे सीएसई-उपचारित कोशिकाओं के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया था, फिर, 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर स्यूडोमोनास से संक्रमित थे। कोशिकाओं का बैक्टीरियल भार तीन अलग-अलग तरीकों से निर्धारित किया गया था। परिणामों से पता चला है कि सीएसई फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में स्यूडोमोनास लोड में वृद्धि हुई । इसलिए, यह प्रोटोकॉल फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Introduction
सिगरेट पीने से दुनिया भर में लाखों लोगों के सार्वजनिक स्वास्थ्य पर असर पड़ता है । फेफड़ों के कैंसर और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) सहित कई हानिकारक बीमारियों को सिगरेट पीने से संबंधित बताया गया है1,,2। सिगरेट पीने से श्वसन तंत्र में तीव्र माइक्रोबियल संक्रमण की संवेदनशीलता बढ़ जाती है3,4,5.5 इसके अलावा , बढ़ते साक्ष्य यह साबित करते हैं कि सिगरेट पीने से कई पुराने विकारों की रोगजनन क्षमता बढ़ती है6,7,8. उदाहरण के लिए, सिगरेट पीने से वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण बढ़ सकता है जो सीओपीडी उत्तेजना9का कारण बनता है। जीवाणु रोगजनकों में से जो सीओपीडी के तीव्र उत्तेजना में योगदान देते हैं, एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक बैसिलस रोगजनक, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,उन संक्रमणों का कारण बनता है जो खराब शकुन और उच्च मृत्यु दर10, 11,11से सहसंबद्ध हैं। सीओपीडी उत्तेजना रोग प्रगति को तेज करके बीमारी को खराब कर देती है। एंटीसिम्प्टोमैटिक मैनेजमेंट12को छोड़कर सीओपीडी के खिलाफ कोई प्रभावी उपचार नहीं हैं । सीओपीडी उत्तेजना रोगी मृत्यु दर को बढ़ावा देती है, जीवन की गुणवत्ता को कम करती है, और समाज पर आर्थिक बोझ बढ़ाती है13।
श्वसन वायुमार्ग एक खुली प्रणाली है, जो लगातार बाहरी रूप से मौजूद विभिन्न माइक्रोबियल रोगजनकों के अधीन है। अवसरवादी जीवाणु रोगजनकों का पता आमतौर पर ऊपरी वायुमार्ग में लगाया जाता है लेकिन कभी – कभी निचले वायुमार्ग14,15में देखा जाता है . पशु मॉडलों में पी एरुगिनोसा को संक्रमण के 16 के बाद 1 घंटे के रूप में अल्वेलर सैक्स में पाया जा सकता है।16 एक प्रमुख रक्षा तंत्र के रूप में, मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं वायुमार्ग में बैक्टीरिया को खत्म कर देती हैं। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाएं, पहली शारीरिक बाधा के रूप में, माइक्रोबियल संक्रमण के खिलाफ मेजबान रक्षा में एक अनूठी भूमिका निभाती हैं। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाएं17प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्वतंत्र माइक्रोबियल आक्रमण, उपनिवेशीकरण या प्रतिकृति को विनियमित कर सकती हैं। पीपीएआरजी सहित एपिथेलियल कोशिकाओं में पाए जाने वाले कुछ अणु जीवाणुरोधी कार्य करते हैं, जिससे फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण और प्रतिकृति को विनियमित किया जाता है18। सिगरेट पीने से अणुओं में परिवर्तन हो सकता है और फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में सामान्य रक्षा कार्य ख़राब हो सकता है19,20 हाल के अध्ययनों में रोबोट धूम्रपान उपकरण का उपयोग करके फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को सिगरेट के धुएं के सीधे संपर्कमें आनेकी सूचना दीगईहै। धुएं के संपर्क में अन्य तरीकों से प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि, सीएसई के आवेदन सहित। सीएसई की तैयारी अन्य सेल प्रकारों में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक प्रजनन योग्य दृष्टिकोण है, जिसमें वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं जो अप्रत्यक्ष रूप से सिगरेट के धुएं के संपर्क में हैं।
यह रिपोर्ट फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड को बदलने के लिए सिगरेट के धुएं के अर्क को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । सीएसई पी एरुगिनोसाके बैक्टीरियल लोड को बढ़ाता है, और यह आमतौर पर सीओपीडी उत्तेजना में देखे जाने वाले बैक्टीरियल संक्रमणों की पुनरावृत्ति में योगदान दे सकता है। सीएसई की तैयारी के लिए एक पारंपरिक विधि का उपयोग किया जाता है। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं, उनके घातीय विकास चरण में, 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, मोनोलेयर-सुसंस्कृत फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को सीधे एयर-लिक्विड इंटरफेस में सिगरेट के धुएं से अवगत कराया जा सकता है। सीएसई-उपचारित कोशिकाओं को तब 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर स्यूडोमोनास के साथ चुनौती दी जाती है। बैक्टीरिया को एक विशेष मिलाते हुए गति से प्रचारित किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उनकी पूर्ण आक्रामक क्षमता को बनाए रखने के लिए उनके फ्लैगेला की आकृति विज्ञान बरकरार रहे। Gentamycin संस्कृति माध्यम में छोड़ दिया बैक्टीरिया को मारने के लिए नियोजित है, जिससे जीवाणु भार के बाद के निर्धारण के दौरान संभावित संदूषण को कम करने । प्रोटोकॉल भी GFP लेबल स्यूडोमोनासका उपयोग करता है, जो विभिन्न मॉडलों में स्यूडोमोनास संक्रमण का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। एक प्रतिनिधि तनाव पी फ्लोरोसेनएस मिगुला23है । सीएसई उपचार के बाद संक्रमण या बैक्टीरियल लोड की डिग्री तीन तरीकों से निर्धारित की जाती है: कॉलोनी गिनती के साथ ड्रॉप प्लेट विधि, स्यूडोमोनास 16S आरएनए-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर, या फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनाससे संक्रमित कोशिकाओं में साइटोमेट्री प्रवाह। यह प्रोटोकॉल फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में जीवाणु आक्रमण जीवाणु संक्रमण के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं में जीवाणु आक्रमण की प्रक्रिया को निम्नलिखित तीन चरणों में तोड़ा जा सकता है: सबसे पहले, बै?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में स्वास्थ्य R01 अनुदान HL125435 और HL142997 (CZ के लिए) के एक राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
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