הכנת תמציות תאים על ידי Cryogrinding במיל מקפיא אוטומטי
Summary
אנו מתארים שיטה אמינה להכנת תמציות תאים שלמים שמרים או תאים אחרים באמצעות טחנת מקפיא cryogenic הממזערת השפלה והשפלה של חלבונים. תמציות התא מתאימות לטיהור של תסביכי חלבון פונקציונליים, ניתוחים פרוטאומיים, מחקרים לפירוק חיסוני וזיהוי שינויים בחלבון labile.
Abstract
הקלות של מניפולציה גנטית ושימור אבולוציוני חזק של מכונות תאיות אאוקריוטיות שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae הפך אותו אורגניזם מודל גנטי טרום תוה. עם זאת, מכיוון שבידוד חלבון יעיל תלוי בשיבוש אופטימלי של תאים, השימוש ב שמרים לניתוח ביוכימי של חלבונים תאיים נפגע על ידי קיר התא שלו שהוא יקר לעיכול אנזימטי (באמצעות lyticase או zymolyase), וקשה לשבש מכנית (באמצעות מקף חרוזים מסורתי, עיתונות צרפתית או מטחנת קפה) מבלי לגרום לחימום של דגימות, אשר בתורו גורם לפירוק חלבון והשפלה. למרות שחיקה ידנית של תאי שמרים תחת חנקן נוזלי (LN2) באמצעות מרגמהועלי מונע התחממות יתר של דגימות, זה עבודה אינטנסיבית וכפוף לשונות בתא lysis בין המפעילים. במשך שנים רבות, אנחנו כבר בהצלחה הכנת תמציות שמרים באיכות גבוהה באמצעות cryogrinding של תאים במפעל מקפיא אוטומטי. הטמפרטורה של -196 °C שהושגה עם השימוש LN2 מגן על החומר הביולוגי מפני השפלה על ידי פרוטאזים וגרעין, המאפשר אחזור של חלבונים שלמים, חומצות גרעין ומקרומולקולות אחרות. כאן אנו מתארים טכניקה זו בפירוט עבור תאי שמרים ניצנים אשר כרוך הראשון הקפאת השעיה של תאים במאגר lysis דרך תוספת dropwiseשלה לתוך LN 2 כדי ליצור טיפות קפואות של תאים המכונה “פופקורן”. פופקורן זה הוא מרוסק לאחר מכן תחת LN2 במפעל מקפיא כדי ליצור קפוא “אבקה” לחלץ אשר מופשר לאט והבהיר על ידי צנטריפוגה כדי להסיר פסולת מסיסה. תמציות וכתוצאה מכך מוכנים ליישומים במורד הזרם, כגון טיהור חלבון או חומצה נוקלית, ניתוחים פרוטאומיים, או מחקרים שיתוף ערך חיסוני. טכניקה זו ישימה באופן נרחב להכנת תמצית תאים ממגוון של מיקרואורגניזמים, רקמות צמחים ובעלי חיים, דגימות ימיות כולל אלמוגים, כמו גם בידוד DNA/RNA מדגימות מאובנים משפטיות ואדמה.
Introduction
שמרים הוא אורגניזם מודל פופולרי עבור מחקרי חלבון, כפי שהוא אורגניזם אאוקריוטי פשוט עם שפע של כלים גנטיים וביוכימיים זמינים עבורחוקרים 1. בשל קיר התאים היתון שלהם, אחד האתגרים העומדים בפני החוקרים הוא בהתפלה יעילה של התאים מבלי לפגוע בתכולת התא. שיטות שונות זמינות לקבלת תמציות חלבון באמצעות שיבוש של תאי שמרים הכוללים אנזימה (zymolyase)2,3, ליזיסכימי 4, ליזיס פיזי על ידי הקפאתהפשרה 5, מבוסס לחץ(עיתונותצרפתית) 6,7 ,מכני (חרוזיזכוכית, מטחנתקפה) 8,9, sonication מבוסס10 ו cryogenic2,11. היעילות של ליזיס התא ותפוקת החלבון יכולה להשתנות במידה ניכרת בהתאם לטכניקה המועסקת, ובכך להשפיע על התוצאה הסופית או על התאמת היישום במורד הזרם הרצוי עבור lysate. כאשר לומדים חלבונים לא יציבים, יש שינויים לאחר התרגום חולף, או רגישים לטמפרטורה, חשוב במיוחד להשתמש בשיטה שתמזער אובדן או ירידה במדגמים במהלך ההכנה.
| טכניקת הכנת חילוץ | פרטים | יתרונות | חסרונות | ניתוח במורד הזרם | הפניה |
| עיתונות צרפתית: הומוגניזר בלחץ גבוה (aka Microfluidizer) עם טיפול נזימטי באמצעות Zymolyase | זימוליז-20T, הומוגניזר מיקרופלוייזר בלחץ גבוה. המשבש מורכב משאבה אוויר מונחה, בלחץ גבוה (יחס 1:250; נדרש לחץ אוויר 0.6-l MPa) ותא שיבוש מיוחד עם יחידת לחץ גב נוספת. גודל מדגם מינימלי של 20 מ”ל נדרש לעיבוד. | השיבוש הכולל הסופי שהושג באמצעות הפרוטוקול המשולב התקרב 100 % עם 4 עובר בלחץ של 95 MPa, לעומת רק 32 % שיבוש עם 4 עובר ב 95 MPa באמצעות הומוגניזציה בלבד ללא Zymolyase. | אינו מתאים ליישומים בקנה מידה קטן. האנזימים יכולים להיות יקרים להכנות בקנה מידה גדול. | טיהור חלבונים | 6 |
| מכה חרוז: תאים שטופלו Zymolyase lysed עם חרוזי זכוכית במכשיר fastprep | בערך נפח שווה של קר, יבש, חומצה שטף 0.5 מ”מ זכוכית חרוזים מתווסף נפח נתון של כדורי תא במאגר lysis ואת התאים משובשים על ידי תסיסה ידנית נמרצת. | זה שימושי במיוחד בעת ביצוע תמציות מתרבויות שמרים קטנות רבות ושונות למטרות ציון ולא לטיהור חלבונים. | במהלך הליך חרוז זכוכית, חלבונים מטופלים בחומרה גרימת קצף נרחב המוביל denaturation חלבון. כמות שבירה תאים משתנה, בעוד proteolysis, כמו גם שינוי של החלבונים עשויים לנבוע חימום של התמצית מעל 4 מעלות צלזיוס במהלך השבירה מכנית. | בעיקר DNA & RNA מנתח, אבל גם ניתוח חלבון על ידי denaturing ג’ל electropheoresis, עם או בלי כתמים מערביים. | 8 |
| טיפול Zymolyase ואחריו lysis באמצעות שילוב של הלם אוסמוטי הומוגניזציה Dounce | לאחר עיכול אנזימטי של קירות התא, spheroplasts הם lysed עם 15 כדי 20 משיכות של עלי הדוק (סיווג 1 עד 3 μm) ב homogenizer Dounce. | יתרון לשימוש זנים protease לקוי כגון BJ926 או EJ101. זוהי הדרך העדינה ביותר לשבור תאי שמרים ולכן היא מתאימה ביותר להכנת תמציות שיכולות לבצע פונקציות אנזימטיות מורכבות (למשל, תרגום, שעתוק, שכפול DNA) ולכן יש לשמור על שלמות המבנים המקרומולקולריים (למשל, ריבוזומים, חביות). זה גם שימושי לבידוד גרעינים שלמים שניתן להשתמש בהם עבור מחקרי כרומטין (בלום ופחמן, 1982) או עבור תמציות חלבון גרעיני (לו וקורנברג, 1987). | החסרונות העיקריים של הליך הליזה spheroplast הם שזה מיגע ויקר יחסית, במיוחד עבור הכנות בקנה מידה גדול (>10 ליטר), ותקופות הדגירה הארוכות יכול להוביל פרוטאוליזה או שינוי חלבון. עבור תכשירים כרומטין, הם נראים באיכות משתנה או נמוכה יותר מאלה המיוצרים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית (מבוסס על שלמות סולם נוקלאוזום). | בידוד גרעינים שלמים עבור מחקרי כרומטין, תמציות שיכולות לבצע פונקציות אנזימטיות מורכבות, תמציות הדורשות את שלמות מבנים מקרומולקולריים, תמציות חלבון גרעיני. |
2 |
| שיבוש תאים של תאים קפואים פלאש על ידי שחיקה חנקן נוזלי באמצעות מרגמה / עלי או בלנדר | תאים קפואים מיד בחנקן נוזלי ולאחר מכן lysed על ידי שחיקה ידנית במרגמה באמצעות עלי, או באמצעות בלנדר Waring בנוכחות חנקן נוזלי. | הפרוטוקול מהיר וקל. זה יכול להכיל כמויות שונות של תאי שמרים כולל תרבויות גדולות מאוד. היתרון העיקרי שלה הוא כי תאים נלקחים באופן מיידי מהמדינה הגדלה באופן פעיל לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C), הפחתת פעילויות אנזימים משפילים כגון פרוטאזים וגרעין, כמו גם פעילויות לשנות חלבונים (למשל, פוספטאזים וkinases). הוא מתאים במיוחד להכנת תמציות תאים שלמים מתרבות שמרים אחת לטיהור חלבונים בקנה מידה גדול. | קצת מבולגן ועלול להיות מסוכן לחוקר רשלני. דגימות קטנות (כלומר, 10- עד 100 מ”ל שמרים תרביות) אינן מעובדות בקלות כי אין מספיק מסה של גושי תאים קפואים כדי לשבור ביעילות בבלנדר. זה זמן רב כדי לעבד דגימות בודדות ולנקות את הציוד בין שימושים. | תמציות תאים שלמים מתרבות שמרים אחת לטיהור חלבונים בקנה מידה גדול. | 2 |
| תסיסה אוטומטית, טחנת חרוזים | pH 5.0, 50 °C, 24 שעות, 200 סל”ד / Ø 0.5 מ”מ, 5 × 3 דקות/3 דקות | תמצית מהירה ויעילה, במיוחד להכנת תמצית בקנה מידה קטן | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. נדרש ציוד מכות חרוזים. | ניתוחים בקנה מידה קטן. | 10 |
| אוטוליזה, Sonication | pH 5.0, 50°C, 24 שעות, 200 סל”ד, 4 × 5 דקות/2 דקות, פולס 80%, הספק 80% | ציוד Sonication זמין בדרך כלל ברוב המוסדות. | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. נדרש ציוד Sonication. האטה איטית יכולה להימשך יותר מ-24 שעות. | הכנות קיר תא שמרים. | |
| תהליך הרתיחה והקפאת ההפשרה | אין צורך בציוד מיוחד מלבד מקפיא סטנדרטי ובלוק חימום או אמבט מים חמים. | יעיל, ניתן לשחזור, פשוט ולא יקר. | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. | ניתוחי די.אן.איי על ידי פי.סי.איי. | 5 |
טבלה 1: השוואת שיטות זמינות להכנת תמציות שמרים.
Cryogrinding (aka טחינה cryogenic / כרסום cryogenic) מועסק בדרך כלל כדי לאחזר חומצות גרעין, חלבונים או כימיקלים מדגימות רגישות לטמפרטורה באופן אמין לניתוחים כמותיים או איכותיים. הוא שימש בהצלחה עבור יישומים מרובים בתחומים מגוונים כולל ביוטכנולוגיה, טוקסיקולוגיה,מדע זיהוי פלילי 12,13, מדעי הסביבה, ביולוגיה צמח14 ומדעי המזון. בידוד של מקרומולקולות ביולוגיות שלמות תלוי בדרך כלל באופן קריטי בטמפרטורה. טמפרטורות נמוכות מאוד להבטיח כי proteases ו nucleases להישאר פעיל, וכתוצאה מכך בידוד אמין של חלבונים שלמים, חומצות גרעין ומקרומולקולות אחרות לניתוחים הבאים. אכן, טחנת מקפיא בדרך כלל שומרת על טמפרטורת מדגם של -196 °C (נקודת הרתיחה של LN2),ובכך למזער DNA / RNA או ירידה בחלבון והשפלה.
טחנת המקפיא משתמשת בתא שחיקה אלקטרומגנטי שמזיז במהירות מוט מתכת מוצק או גליל הלוך ושוב בתוך בקבוקון המכיל את הדגימה כדי להיות מרוסק בין אטמי קצה נירוסטה. המכשיר יוצר והופך במהירות שדה מגנטי בתוך תא הטחינה. כאשר השדה המגנטי נע הלוך ושוב, המגנט מוחץ את הדגימה כנגד התקעים ובכך משיג את ה”קריוגרינדינג” ואת הריסת הפופקורן. טחנת המקפיא מחליפה את המרגמה והעלי ומאפשרת עיבוד רציפה של דגימות מרובות (או עד 4 דגימות קטנות יותר בו-זמנית) עם יכולת רבייה גבוהה ומומנעת את השונות של המשתמש למשתמש הקשורה לטחינה ידנית. לאחר עיבוד הדגימות, ניתן להשתמש בתמציות התא עבור מגוון יישומים במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מגבלה של לימוד חלבונים מקומיים שמרים היא התסיסה הלא יעילה של תאי שמרים בשל קיר התא הקשה שלהם. למרות שפותחו מספר שיטות, השיטה העקבית והיעילה ביותר בידיים שלנו היא cryogrinding של תאי שמרים פלאש קפוא כמו פופקורן. שיטה זו מאפשרת הכנה אמינה של תמציות תאים שלמים באיכות גבוהה שמרים ניצנים בהשוואה לשיט…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר במעבדת Gunjan נתמך על ידי מימון של המכונים הלאומיים לבריאות, הקרן הלאומית למדע ומשרד הבריאות של פלורידה. אנו מודים לסטודנט לתואר ראשון ג’ון פרקר על הסיוע הטכני.
Materials
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
- Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
- Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
- Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
- Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
- Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
- Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
- Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
- Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
- Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
- Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
- Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
- Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
- Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
- Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
- Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
- Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
- Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
- da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
- Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
- Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
- Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).
