Beredning av Cell Extrakt av Cryogrinding i en automatiserad Frys Mill

Summary

Vi beskriver en tillförlitlig metod för beredning av hela cellextrakt från jäst eller andra celler med hjälp av en kryogen frys kvarn som minimerar nedbrytning och denaturering av proteiner. Cellextrakten är lämpliga för rening av funktionella proteinkomplex, proteomiska analyser, co-immunoprecipitationsstudier och detektion av labila proteinmodifieringar.

Abstract

Den lätthet genetisk manipulation och den starka evolutionära bevarande av eukaryota cellulära maskiner i spirande jäst Saccharomyces cerevisiae har gjort det en framstående genetisk modell organism. Men eftersom effektiv proteinisolering beror på optimal störning av celler, hämmas användningen av jäst för biokemisk analys av cellulära proteiner av dess cellvägg som är dyr att smälta enzymatiskt (med hjälp av lyticase eller zymolyase), och svårt att störa mekaniskt (med hjälp av en traditionell pärlvisp, en fransk press eller en grind kaffebryggare) utan att orsaka uppvärmning av prover, vilket i sin tur orsakar protein denaturering och nedbrytning. Även om manuell malning av jästceller under flytande kväve (LN₂) med hjälp av en mortel och mortelstöt undviker överhettning av prover, är det arbetsintensivt och föremål för variabilitet i celllys mellan operatörer. Under många år har vi framgångsrikt förbereda hög kvalitet jästextrakt med hjälp av cryogrinding av celler i en automatiserad frys kvarn. Temperaturen på -196 °C som uppnås vid användning av LN₂ skyddar det biologiska materialet från nedbrytning genom proteaser och nukleaser, vilket möjliggör hämtning av intakta proteiner, nukleinsyror och andra makromolekyler. Här beskriver vi denna teknik i detalj för blivande jästceller som innebär att först frysa en suspension av celler i en lysbuffert genom sin dropwise tillägg till LN₂ för att generera frysta droppar av celler som kallas “popcorn”. Detta popcorn pulvriseras sedan under LN₂ i en frys kvarn för att generera en fryst “pulveriserad” extrakt som tinas långsamt och förtydligas genom centrifugeringen för att avlägsna olösligt skräp. De resulterande extrakten är redo för nedströms applikationer, såsom protein eller nukleinsyra rening, proteomiska analyser, eller co-immunoprecipitation studier. Denna teknik är allmänt tillämplig för cell extrakt beredning från en mängd olika mikroorganismer, växt-och djurvävnader, marina exemplar inklusive koraller, samt isolera DNA / RNA från kriminaltekniska och permafrost fossila exemplar.

Introduction

Jäst är en populär modell organism för protein studier, eftersom det är en enkel eukaryota organism med ett överflöd av genetiska och biokemiska verktyg som finns för forskare¹. På grund av deras robusta cellvägg, en utmaning som forskarna står inför är att effektivt lysa cellerna utan att skada det cellulära innehållet. Olika metoder finns för att erhålla proteinextrakt genom störningar av jästceller som inkluderar enzymatisk lys (zymolyas)^2,3, kemisk lys⁴, fysisk lys genom frys-tö⁵, tryckbaserad (fransk press)^6,7, mekaniska (glaspärlor, grind coffeeer)^8,9, ultraljudsbehandling-baserad¹⁰ och kryogen^2,11. Effektiviteten av celllys och proteinavkastningen kan variera betydligt beroende på den använda tekniken, vilket påverkar slutresultatet eller lämpligheten för den önskade nedströmsapplikationen för lysate. När man studerar proteiner som är instabila, har flyktiga posttranslationella modifieringar, eller är temperaturkänsliga, är det särskilt viktigt att använda en metod som kommer att minimera provförlust eller nedbrytning under beredningen.

Extrakt förberedelseteknik	Detaljer	Fördelar	Nackdelar	Analys nedströms	Referens
Fransk press: Högtrycks homogenisator (aka Microfluidizer) med enzymatisk förbehandling med hjälp av Zymolyase	Zymolyase-20T, en Microfluidizer högtrycks homogenisator. Disruptorn består av en luftdriven högtryckspump (förhållandet 1:250; erforderligt lufttryck 0,6-l MPa) och en särskild störningskammare med en extra backtrycksenhet. En minsta provstorlek på 20 mL krävs för bearbetning.	Slutlig total störning som erhölls med hjälp av det kombinerade protokollet, att närma sig 100% med 4 passerar på en pressa av 95 MPa, som jämfört till endast 32% avbrott med 4 passerar på 95 MPa som använder endast homogenisering utan Zymolyasen.	Inte lämpligt för småskaliga applikationer. Enzymerna kan bli dyra för storskaliga preparat.	Protein rening	6
Bead beater: Zymolyase behandlade celler lyst med glaspärlor i ett snabbprep instrument	Ungefär en lika stor volym av kalla, torra, syratvättade 0,5 mm glaspärlor tillsätts till en given volym cellpellets i lysbuffert och cellerna störs av kraftig manuell agitation.	Det är särskilt användbart när man gör extrakt från många olika små jäst kulturer för assaying ändamål snarare än för protein rening.	Under glaspärla förfarandet, proteiner behandlas hårt orsakar omfattande skumning leder till protein denaturering. Mängden cellbrott varierar, medan proteolys samt modifiering av proteinerna kan bli följden av uppvärmning av extraktet över 4°C under den mekaniska brottningen.	Mestadels DNA & RNA analyser, men också proteinanalys genom denaturering av gel elektroforesis, antingen med eller utan västerländsk blotting.	8
Zymolyasbehandling följt av lys med hjälp av en kombination av osmotisk chock och Dounce-homogenisering	Efter enzymatisk matsmältning av cellväggar, spheroplasts lystnas med 15 till 20 slag av en åtsittande mortelstöt (clearance 1 till 3 μm) i en Dounce homogenisator.	Fördelaktigt att använda proteas-bristfälliga stammar som BJ926 eller EJ101. Detta är det skonsammaste sättet att bryta jästceller och därmed är det mest lämpligt för att förbereda extrakt som kan utföra komplexa enzymatiska funktioner (t.ex. översättning, transkription, DNA-replikation) och där makromolekylära strukturers integritet (t.ex. ribosomer, skarvskulor) måste upprätthållas. Det är också användbart för att isolera intakta kärnor som kan användas för kromatinstudier (Bloom and Carbon, 1982) eller för kärnproteinextrakt (Lue och Kornberg, 1987).	De stora nackdelarna med spheroplast lysproceduren är att det är relativt tråkiga och dyra, särskilt för storskaliga preparat (> 10 liter), och de långa inkubationsperioderna kan leda till proteolys eller proteinmodifiering.  För kromatinpreparat verkar de vara av varierande eller lägre kvalitet än de som produceras av differentialcentrifugeringen (baserat på nukleosom stegeintegritet).	Isolera intakta kärnor för kromatinstudier, extrakt som kan utföra komplexa enzymatiska funktioner, extrakt som kräver integriteten hos makromolekylära strukturer, kärnproteinextrakt.	2
Cell Disruption of flash frozen cells by grinding in Liquid Nitrogen using a mortar/pestle or a blender	Celler fryses omedelbart i flytande kväve och sedan lysts genom slipning manuellt i en mortel med hjälp av en mortelstöt, eller med hjälp av en Waring mixer i närvaro av flytande kväve.	Protokollet är snabbt och enkelt. Det kan rymma varierande mängder jästceller inklusive mycket stora kulturer. Dess främsta fördel är att celler tas omedelbart från det aktivt växande tillståndet till flytande kväve (−196°C), minskande nedbrytande enzymaktiviteter som proteaser och nukleaser samt aktiviteter som modifierar proteiner (t.ex. fosfataser och kinaser). Det är särskilt lämpad för att göra hel-cell extrakt från en enda jäst kultur för storskalig protein rening.	Lite rörigt och potentiellt farligt för den slarviga utredaren. Små prover (dvs. 10- till 100-ml jästkulturer) bearbetas inte lätt eftersom det inte finns tillräckligt med massa frysta cellklump för att bryta effektivt i mixern. Det är tidskrävande att bearbeta enskilda prover och att rengöra utrustningen mellan användningarna.	Helcellsextrakt från en enda jästkultur för storskalig proteinrening.	2
Autolys, Pärlkvarn	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Snabb och effektiv lys, särskilt för småskalig extraktpreparering	Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler. Bead slå utrustning krävs.	Småskaliga analyser.	10
Autolys, Ultraljudsbehandling	pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 varv/min, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, effekt 80%	Ultraljudsbehandling utrustning är vanligtvis tillgänglig i de flesta institutioner.	Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler. Ultraljudsbehandling utrustning krävs. Långsam lys kan ta mer än 24 timmar.	Jäst cell vägg preparat.
Kokning och frys-tina-process	Ingen specialutrustning behövs annat än en vanlig frys och ett värmeblock eller varmvattenbad.	Effektiv, reproducerbar, enkel och billig.	Värmegenerering leder till denaturering och nedbrytning av makromolekyler.	DNA-analyser av PCR.	5

Tabell 1: Jämförelse av metoder som finns tillgängliga för beredning av jästextrakt.

Kryogrinding (aka kryogen slipning/kryogen fräsning) används vanligen för att hämta nukleinsyror, proteiner eller kemikalier från temperaturkänsliga prover på ett tillförlitligt sätt för kvantitativa eller kvalitativa analyser. Det har använts framgångsrikt för flera tillämpningar inom olika områden, inklusive bioteknik, toxikologi,^{forensisk vetenskap 12,13}, miljövetenskap,^{växtbiologi 14} och livsmedelsvetenskap. Isolering av intakta biologiska makromolekyler är vanligtvis kritiskt beroende av temperaturen. Extremt låga temperaturer säkerställer att proteaserna och nukleaserna förblir inaktiva, vilket resulterar i en tillförlitlig isolering av intakta proteiner, nukleinsyror och andra makromolekyler för efterföljande analyser. En fryskvarn bibehåller i själva verket typiskt en provtemperatur på -196 °C (kokpunkten för LN₂), vilket minimerar DNA/RNA eller proteindenaturering och nedbrytning.

Frysverket använder en elektromagnetisk slipkammare som snabbt flyttar en solid metallstång eller cylinder fram och tillbaka inom en injektionsflaska som innehåller provet som ska pulveriseras mellan rostfria ändpluggar. Instrumentet skapar och vänder snabbt ett magnetfält inom slipkammaren. När magnetfältet skiftar fram och tillbaka, krossar magneten provet mot pluggarna och uppnår på så sätt “kryogrinderingen” och pulveriseringen av popcornen. Frysverket ersätter mortel och mortel och tillåter sekventiell bearbetning av flera prover (eller upp till 4 mindre prover samtidigt) med hög reproducerbarhet och undviker variabiliteten för användaren i samband med manuell malning. När proverna har bearbetats kan cellextrakten användas för en mängd olika nedströmsapplikationer.

Protocol

1. Beredning av jäst Popcorn Odla jästceller i 0,5 L av YPD-media till en densitet på 1 x 107 celler/mL. Räkna celler med hjälp av en Coulter Counter eller något annat sätt. Centrifugeringsceller i 10 min vid 2 400 g och 4 °C. Tvätta varje prov en gång med 500 mL iskallt avjoniserat 18 mega Ohm Milli-Q vatten. Resuspend pellets i 15 mL av iskall Lys Buffert [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycerol, med nytillsats reduktionsmedel 10 mM β-me…

Representative Results

Vi jämförde två olika metoder för jästcellslys, nämligen glaspärla fräsning vid 4 °C och en automatiserad kryogrinderande metod vid -196 °C, för att bedöma de relativa återvinningsproteinerna i cellextrakten som utarbetats med båda metoderna. För denna studie valde vi att använda en spirande jäststam YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 redovi…

Discussion

En begränsning av att studera inhemska proteiner från jäst är ineffektiva lys av jästceller på grund av deras tuffa cellvägg. Även om flera metoder har utvecklats, är den mest konsekventa och effektiva metoden i våra händer kryogrindningen av jästceller flashfryst som popcorn. Denna metod möjliggör tillförlitlig beredning av högkvalitativa hela cellextrakt från knoppande jäst jämfört med andra lysmetoder. De representativa resultaten visade att kryogrindningen är överlägsen en populär mekanisk met…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent