Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması
Summary
Biz bozulma ve proteinlerin denatürasyonu en aza indirgeyen bir kriyojenik dondurucu değirmen kullanarak maya veya diğer hücrelerden tüm hücre özleri hazırlanması için güvenilir bir yöntem açıklar. Hücre ekstreleri fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, proteomik analizler, ko-immünopresipite çalışmaları ve labile protein modifikasyonlarının saptanması için uygundur.
Abstract
Genetik manipülasyon kolaylığı ve tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotik hücresel makine güçlü evrimsel koruma önde gelen bir genetik model organizma yaptı. Ancak, verimli protein izolasyonu hücrelerin optimal bozulmasına bağlı olduğundan, hücresel proteinlerin biyokimyasal analizi için maya kullanımı enzimatik olarak sindirimi pahalı olan hücre duvarı tarafından engellenir (liticase veya zimolyase kullanarak), ve mekanik olarak bozması zor (geleneksel boncuk çırpıcı kullanarak, bir Fransız presi veya kahve öğütücü) örneklerin ısıtılmasına neden olmadan, bu da protein denatürasyon ve bozulmaya neden olur. Sıvı azot (LN2)altında maya hücrelerinin harç ve havaneli kullanılarak elle öğütülmesi numunelerin aşırı ısınmasını önlese de, emek yoğundur ve operatörler arasında hücre lysis’inde değişkenliğe maruz kalır. Uzun yıllar boyunca, biz başarıyla otomatik bir dondurucu değirmenhücrelerinin kriyogrinding kullanarak yüksek kaliteli maya özleri hazırlanıyor. LN2 kullanımı ile elde edilen -196 °C’lik sıcaklık biyolojik materyali proteazlar ve nükleazlar tarafından bozulmasına karşı koruyarak bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin alınmasını sağlar. Burada bu tekniği ayrıntılı olarak “patlamış mısır” olarak bilinen hücrelerin dondurulmuş damlacıkları oluşturmak için LN2 içine damla akıllıca eklenmesi ile bir lysis tampon hücrelerin in bir süspansiyon dondurma içeren maya hücreleri tomurcuklanma için açıklar. Bu patlamış mısır sonra yavaş yavaş çözülür ve çözünmez enkaz kaldırmak için santrifüj ile açıklığa kavuşturulmuş bir dondurulmuş “toz” özü oluşturmak için bir dondurucu değirmende LN2 altında pulverize edilir. Elde edilen ekstreler protein veya nükleik asit saflaştırma, proteomik analizler veya ko-immünoprepitasyon çalışmaları gibi downstream uygulamaları için hazırdır. Bu teknik, çeşitli mikroorganizmalar, bitki ve hayvan dokuları, mercanlar da dahil olmak üzere deniz numuneleri ve adli ve permafrost fosil örneklerinden DNA/RNA izole etmek için hücre ekstresi hazırlanması için yaygın olarak uygulanabilir.
Introduction
Maya protein çalışmaları için popüler bir model organizma, bu araştırmacılar için kullanılabilir genetik ve biyokimyasal araçların bir bolluk ile basit bir ökaryotik organizma olduğu gibi1. Sağlam hücre duvarlarından dolayı, araştırmacıların karşılaştıkları bir zorluk, hücresel içeriklere zarar vermeden hücreleri verimli bir şekilde dinleyerek. Enzimatik lysis (zimolyaz)2,3, kimyasal lysis4, fiziksel lysis donma-çözülme5, basınç tabanlı (Fransız basın)6,7, mekanik (cam boncuk, kahve öğütücü)8,9, sonication tabanlı10 ve kriyojenik2,11içeren maya hücrelerinin bozulması yoluyla protein özleri elde etmek için farklı yöntemler mevcuttur . Hücre lisisinin ve protein veriminin etkinliği kullanılan tekniğe bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir, böylece lysate için istenilen downstream uygulaması için sonuç veya uygunluk etkiler. Kararsız, geçici çeviri sonrası modifikasyonları olan veya ısıya duyarlı proteinleri incelerken, hazırlık sırasında numune kaybını veya bozulmasını en aza indirecek bir yöntem kullanmak özellikle önemlidir.
| Özü hazırlama tekniği | Şey | Avantaj -ları | Dezavantaj -ları | Akış aşağı analizi | Başvuru |
| Fransız basını: Zymolyase kullanılarak enzimatik ön işlem ile yüksek basınçlı homogenizer (diğer adıyla Mikroakışkanlaştırıcı) | Zymolyase-20T, mikroakışkan yüksek basınçlı homojen. Kırıcı, hava tahrikli, yüksek basınçlı pompa (oran 1:250; gerekli hava basıncı 0.6-l MPa) ve ek bir geri basınç ünitesi ile özel bir bozulma odası oluşur. İşlem için en az 20 mL numune boyutu gereklidir. | Kombine protokol kullanılarak elde edilen nihai toplam bozulma 95 MPa basınçta 4 geçişle %100’e yaklaşırken, Zymolyase olmadan sadece homojenizasyon kullanılarak 95 MPa’da 4 geçişle sadece %32’lik bir bozulma yaşandı. | Küçük ölçekli uygulamalar için uygun değildir. Enzimler büyük ölçekli preparatlar için pahalı alabilirsiniz. | Protein arınması | 6 |
| Boncuk çırpıcı: Zymolyaz e-misli bir fastprep aletinde cam boncuklarla lysed işlenmiş hücreler | Kabaca eşit hacimde soğuk, kuru, asitle yıkanmış 0,5 mm cam boncuk, lysis tamponundaki belirli bir hücre peleti hacmine eklenir ve hücreler güçlü manuel ajitasyon ile bozulur. | Özellikle protein arınması yerine, atasözü amacıyla birçok farklı küçük maya kültüründen özler yaparken yararlıdır. | Cam boncuk işlemi sırasında, proteinler sert protein denatürasyonuna yol açan geniş köpük neden sert tedavi edilir. Hücre kırılması miktarı değişirken, proteozis ve proteinlerin modifikasyonu mekanik kırılma sırasında ekstrenin 4°C’nin üzerinde ısınmasından kaynaklanabilir. | Çoğunlukla DNA ve RNA analizleri, aynı zamanda jel elektropheorez denaturing tarafından protein analizi, ya da Batı lekeleme olmadan. | 8 |
| Ozmotik şok ve Dounce homojenizasyon kombinasyonu kullanılarak izlenme ardından zimolyaz tedavisi | Hücre duvarlarının enzimatik sindiriminden sonra, spheroplastlar bir Dounce homogenizer’de 15-20 vuruşluk dar bir havanele (açıklık 1-3 μm) ile lizededilir. | BJ926 veya EJ101 gibi proteease-eksik suşları kullanmak için avantajlı. Bu maya hücrelerini kırmak için en nazik yoludur ve bu nedenle karmaşık enzimatik işlevleri (örneğin, çeviri, transkripsiyon, DNA çoğaltma) yürütebilir ve hangi makromoleküler yapıların bütünlüğü (örneğin, ribozomlar, splicesomes) muhafaza edilmelidir özleri hazırlamak için en uygundur. Kromatin çalışmaları (Bloom ve Carbon, 1982) veya nükleer protein özleri için kullanılabilen sağlam çekirdeklerin izole edilmesinde de yararlıdır (Lue ve Kornberg, 1987). | Spheroplast lysis prosedürünün en büyük dezavantajları, özellikle büyük ölçekli preparatlar için (>10 litre) nispeten sıkıcı ve pahalı olması ve uzun kuluçka süreleri proteoziz veya protein modifikasyonuna yol açabilir. Kromatin preparatları için, diferansiyel santrifüj (nükleozom merdiven bütünlüğüne dayalı) tarafından üretilenlerden farklı veya daha düşük kalitede dir. | Kromatin çalışmaları için bozulmamış çekirdekleri izole etmek, karmaşık enzimatik işlevleri yerine getirebilen ekstreler, makromoleküler yapılar, nükleer protein özleri. |
2 |
| Bir harç/havaneli veya blender kullanarak Sıvı Azot taşlama tarafından flaş dondurulmuş hücrelerin Hücre Bozulması | Hücreler hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur ve daha sonra bir havaneli kullanarak bir harç elle öğütülerek, ya da sıvı azot varlığında bir Waring blender kullanılarak lysed. | Protokol hızlı ve kolay. Bu çok büyük kültürler de dahil olmak üzere maya hücrelerinin değişen miktarlarda barındırabilir. En büyük avantajı, hücrelerin aktif olarak büyüyen durumdan hemen sıvı nitrojene (−196°C) alınması, proteazlar ve nükleazlar gibi bozunatif enzim aktivitelerinin azalması ve proteinleri (örn. fosfatazlar ve kinases) değiştiren aktivitelerdir. Özellikle büyük ölçekli protein arıtma için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri yapmak için uygundur. | Biraz dağınık ve dikkatsiz araştırmacı için potansiyel olarak tehlikeli. Küçük numuneler (yani, 10- 100 ml maya kültürleri) kolayca işlenmez, çünkü blender’da etkili bir şekilde kırılmak için yeterli dondurulmuş hücre kümeleri kütlesi yoktur. Tek tek numuneleri işlemek ve kullanımlar arasındaki ekipmanı temizlemek zaman alır. | Büyük ölçekli protein arınması için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri. | 2 |
| Otolsis, Boncuk değirmeni | pH 5.0, 50 °C, 24 saat, 200 devir / Ø 0.5 mm, 5 × 3 dk/3 dk | Özellikle küçük ölçekli ekstre hazırlama için hızlı ve verimli bir şekilde | Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Boncuk dayak ekipmanları gerekli. | Küçük ölçekli analizler. | 10 |
| Otolsis, Sonication | pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 dk/2 dk, pulser %80, güç %80 | Sonication ekipman genellikle çoğu kurumda mevcuttur. | Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Sonication ekipman gerekli. Yavaş lysis 24 saatten fazla sürebilir. | Maya hücre duvar hazırlıkları. | |
| Kaynama ve donma-çözülme işlemi | Standart bir dondurucu ve ısıtma bloğu veya sıcak su banyosu dışında özel ekipman gerekli değildir. | Verimli, tekrarlanabilir, basit ve ucuz. | Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. | PCR tarafından DNA analizi. | 5 |
Tablo 1: Maya özlerinin hazırlanmasında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması.
Kriyogrinding (aka kriyojenik taşlama / kriyojenik frezeleme) genellikle nicel veya nitel analizler için güvenilir bir şekilde sıcaklığa duyarlı örneklerden nükleik asitler, proteinler veya kimyasallar almak için kullanılır. Biyoteknoloji, toksikoloji, adli tıp12,13,çevre bilimi, bitki biyolojisi14 ve gıda bilimi gibi çeşitli alanlarda birçok uygulama için başarıyla kullanılmaktadır. Bozulmamış biyolojik makromoleküllerin izolasyonu genellikle sıcaklığa bağlıdır. Son derece düşük sıcaklıklar proteazların ve nükleazların inaktif kalmasını sağlar ve bu da sonraki analizler için bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin güvenilir bir şekilde izole edilmesini sağlar. Gerçekten de, bir dondurucu değirmeni tipik olarak -196 °C (LN2kaynama noktası) bir örnek sıcaklığı korur, böylece DNA / RNA veya protein denatürasyonu ve bozulmaen en aza indirir.
Dondurucu değirmeni, paslanmaz çelik uç fişler arasında toz haline getirilecek numuneyi içeren bir şişe içinde katı metal bir çubuğu veya silindiri hızla ileri geri hareket ettiren bir elektromanyetik taşlama odası kullanır. Alet, taşlama odası içinde bir manyetik alan oluşturur ve hızla tersine çevirir. Manyetik alan ileri geri kayıyorgibi, mıknatıs fişlere karşı örnek ezerek ‘kriyogrinding’ ve patlamış mısır pulverization elde. Dondurucu değirmeni harç ve havanelinin yerini alır ve birden fazla numunenin (veya aynı anda en fazla 4 küçük numunenin) yüksek tekrarlanabilirlik ile sıralı olarak işlenmesine izin verir ve manuel taşlama ile ilişkili kullanıcı-kullanıcı değişkenliğini önler. Örnekler işlendikten sonra, hücre ekstreleri çeşitli akış aşağı uygulamaları için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mayadan alınan yerli proteinlerin incelenmesinin bir sınırlaması, sert hücre duvarlarından dolayı maya hücrelerinin verimsiz bir şekilde çalışmasıdır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiş olmasına rağmen, elimizde en tutarlı ve verimli yöntem patlamış mısır gibi dondurulmuş maya hücrelerinin flaş kriyogrinding olduğunu. Bu yöntem, tomurcuklanan mayadan elde edilen yüksek kaliteli tüm hücre ekstrelerinin diğer lysis yöntemlerine göre güvenilir bir şekilde hazırlanmasını sağlar. Temsi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gunjan laboratuvarındaki araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı ve Florida Sağlık Bakanlığı’nın finansmanı ile desteklenmiştir. Lisans öğrencisi John Parker’a teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
- Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
- Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
- Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
- Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
- Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
- Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
- Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
- Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
- Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
- Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
- Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
- Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
- Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
- Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
- Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
- Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
- Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
- da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
- Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
- Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
- Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).
