إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي
Summary
نحن وصف طريقة موثوقة لإعداد مستخلصات الخلية كاملة من الخميرة أو الخلايا الأخرى باستخدام مطحنة التجميد المبردة التي تقلل من تدهور وdenaturation البروتينات. مستخلصات الخلايا مناسبة لتنقية مجمعات البروتين الوظيفية، وتحليلات البروتيوم، ودراسات المناعة المشتركة والكشف عن تعديلات البروتين labile.
Abstract
سهولة التلاعب الجيني والحفاظ التطوري القوي للآلات الخلوية eukaryotic في خميرة في مهدها Saccharomyces cerevisiae جعلت من كائن حي النموذج الوراثي البارز. ومع ذلك ، نظرًا لأن عزل البروتين الفعال يعتمد على التعطيل الأمثل للخلايا ، فإن استخدام الخميرة للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتينات الخلوية يعوقه جدار الخلية المكلف بهضم الأنزيمية (باستخدام lyticase أو zymolyase) ، ويصعب تعطيله ميكانيكيًا (باستخدام مضرب حبة تقليدي أو مطبعة فرنسية أو طاحونة قهوة) دون التسبب في تسخين العينات ، مما يسبب بدوره تذوّق البروتينات وتدهورها. على الرغم من أن طحن يدوي من خلايا الخميرة تحت النيتروجين السائل (LN2) باستخدام مدافع الهاون و pestle يتجنب ارتفاع درجة حرارة العينات ، فإنه كثيف العمالة ويخضع للتقلب في تحلل الخلايا بين المشغلين. لسنوات عديدة، ونحن قد تم إعداد بنجاح مقتطفات الخميرة عالية الجودة باستخدام cryogrinding الخلايا في مطحنة التجميد الآلي. درجة حرارة -196 درجة مئوية التي تحققت باستخدام LN2 يحمي المواد البيولوجية من التحلل بواسطة البروتيوسات والنيوكلاسيس، مما يسمح باسترجاع البروتينات السليمة والأحماض النووية والجزيئات الأخرى. هنا وصفنا هذه التقنية بالتفصيل لخلايا الخميرة الناشئة التي تنطوي على تجميد أول تعليق الخلايا في عازلة تحلل من خلال إضافة قطرة في LN2 لتوليد قطرات المجمدة من الخلايا المعروفة باسم “الفشار”. ثم يتم سحق هذا الفشار تحت LN2 في مطحنة الفريزر لتوليد استخراج “مسحوق” المجمدة التي يتم إذابتها ببطء وتوضيحها عن طريق الطرد المركزي لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. المقتطفات الناتجة جاهزة لتطبيقات المصب، مثل تنقية البروتين أو الحمض النووي، أو التحليلات البروتومية، أو دراسات المناعة المشتركة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لإعداد استخراج الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة النباتية والحيوانية والعينات البحرية بما في ذلك الشعاب المرجانية ، فضلا عن عزل الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي من الطب الشرعي والعينات الأحفورية الدائم التجمد.
Introduction
الخميرة هي كائن نموذجي شعبي لدراسات البروتين ، كما هو كائن حي بسيط eukaryotic مع وفرة من الأدوات الوراثية والكيميائية الحيوية المتاحة للباحثين1. بسبب جدار الخلية قوي، أحد التحديات التي يواجهها الباحثون هو في lysing بكفاءة الخلايا دون الإضرار محتويات الخلوية. تتوفر طرق مختلفة للحصول على مستخلصات البروتين من خلال تعطيل خلايا الخميرة التي تشمل تحلل انزيمي (zymolyase)2،3، تحلل كيميائي4، تحلل طبيعي عن طريق التجميد ذوبان5، الضغط القائم على (الصحافة الفرنسية)6،7، الميكانيكية (الخرز الزجاجي ، طاحونة القهوة)8،9،10 و 10 ، و11 . يمكن أن تختلف كفاءة تحلل الخلايا وغلة البروتين بشكل كبير اعتمادًا على التقنية المستخدمة ، مما يؤثر على النتيجة النهائية أو ملاءمة التطبيق المطلوب للمصب للlysate. عند دراسة البروتينات غير المستقرة، لديها تعديلات عابرة بعد التراتف، أو حساسة لدرجة الحرارة، من المهم بشكل خاص استخدام طريقة من شأنها تقليل فقدان العينة أو تدهور أثناء التحضير.
| استخراج تقنية إعداد | التفاصيل | مزايا | عيوب | تحليل المصب | مرجع |
| الصحافة الفرنسية: التجانس عالي الضغط (الملقب Microfluidizer) مع المعالجة المسبقة الأنزيمية باستخدام Zymolyase | Zymolyase-20T، وهو التجانس Microfluidizer الضغط العالي. ويتكون المعرقل من مضخة ذات ضغط عال تحركها الهواء (نسبة 1:250؛ ضغط الهواء المطلوب 0.6-l-MPa) وغرفة تعطيل خاصة مع وحدة ضغط الظهر إضافية. مطلوب عينة حجم الحد الأدنى من 20 مل للمعالجة. | التعطيل النهائي الكلي الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول المشترك اقترب من 100٪ مع 4 تمريرات بضغط 95 MPa ، مقارنة فقط بـ 32 ٪ من التعطيل مع 4 تمريرات في 95 MPa باستخدام التجانس فقط بدون Zymolyase. | غير مناسب للتطبيقات الصغيرة الحجم. يمكن الحصول على الإنزيمات باهظة الثمن للمستحضرات على نطاق واسع. | تنقية البروتين | 6 |
| مضرب الخرز: الخلايا المعالجة Zymolyase مع حبات زجاجية في أداة fastprep | تقريبا يتم إضافة حجم متساو من الباردة والجافة، وحمض غسلها حبات الزجاج 0.5 ملم إلى حجم معين من بيليه الخلية في العازلة تحلل وتعطلت الخلايا عن طريق التحريض اليدوي قوية. | ومن المفيد بشكل خاص عند صنع مقتطفات من العديد من الثقافات الخميرة الصغيرة المختلفة لأغراض فحص بدلا من تنقية البروتين. | خلال إجراء حبة الزجاج، يتم التعامل مع البروتينات بقسوة مما تسبب في رغوة واسعة النطاق مما يؤدي إلى denaturation البروتين. كمية من كسر الخلية تختلف, في حين أن تحلل البروتين وكذلك قد تنتج عن تعديل البروتينات من تسخين استخراج فوق 4 درجة مئوية أثناء الكسر الميكانيكية. | في الغالب الحمض النووي وتحاليل الحمض النووي الريبي، ولكن أيضا تحليل البروتين عن طريق denaturing electropheoresis هلام، إما مع أو بدون النشاف الغربية. | 8 |
| علاج Zymolyase تليها تحلل باستخدام مزيج من الصدمة التناضحة والتجانس دونيس | بعد الهضم الأنزيمي من جدران الخلايا، يتم lysed رأب البلاست مع 15 إلى 20 السكتات الدماغية من الحشرات ضيق المناسب (إزالة 1 إلى 3 ميكرومتر) في التجانس Dounce. | مفيد لاستخدام سلالات protease ناقصة مثل BJ926 أو EJ101. هذه هي ألطف طريقة لكسر خلايا الخميرة وبالتالي هو الأكثر ملاءمة لإعداد مقتطفات التي يمكن أن تقوم بوظائف الأنزيمية المعقدة (على سبيل المثال، الترجمة، النسخ، النسخ المتماثل الحمض النووي) والتي سلامة الهياكل الجزيئية (على سبيل المثال، الريبوسومات، لصقات) يجب الحفاظ عليها. ومن المفيد أيضا لعزل النوى سليمة التي يمكن استخدامها لدراسات الكروماتين (بلوم والكربون، 1982) أو لاستخراج البروتين النووي (لو وكورنبرغ، 1987). | العيوب الرئيسية لإجراء تجميل اللواء هي أنها مملة نسبيا ومكلفة، وخاصة بالنسبة للمستحضرات على نطاق واسع (>10 لتر)، وفترات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى تحلل البروتين أو تعديل البروتين. بالنسبة لمستحضرات الكروماتين ، يبدو أنها ذات جودة متفاوتة أو أقل من تلك التي تنتجها التفاضلية الطرد المركزي (على أساس سلامة سلم النيوكلوزومات). | عزل نوى سليمة لدراسات الكروماتين، مقتطفات التي يمكن أن تقوم بها وظائف الأنزيمية المعقدة، مقتطفات تتطلب سلامة هياكل الجزيئات، مستخلصات البروتين النووي. |
2 |
| تعطيل الخلية من الخلايا المجمدة فلاش عن طريق طحن في النيتروجين السائل باستخدام هاون / الحشرات أو خلاط | يتم تجميد الخلايا على الفور في النيتروجين السائل ثم طحنها يدويا في هاون باستخدام الحشرات، أو باستخدام خلاط وارينغ في وجود النيتروجين السائل. | البروتوكول سريع وسهل. ويمكن أن تستوعب كميات مختلفة من خلايا الخميرة بما في ذلك الثقافات الكبيرة جدا. وتتمثل ميزتها الرئيسية في أن الخلايا تؤخذ مباشرة من الحالة المتنامية بنشاط إلى النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية)، مما يقلل من أنشطة الإنزيمات التحللية مثل البروتياسات والنوى وكذلك الأنشطة التي تعدل البروتينات (مثل الفوشطات وال كيناس). وهي مناسبة بشكل خاص لصنع مستخلصات الخلية الكاملة من ثقافة خميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع. | فوضوي بعض الشيء ويحتمل أن يكون خطيرا على المحقق الإهمال. عينات صغيرة (أي، 10-إلى 100-مل الثقافات الخميرة) لا تتم معالجتها بسهولة لأنه لا توجد كتلة كافية من كتل الخلايا المجمدة لكسر فعال في الخلاط. ومن تستغرق وقتا طويلا لمعالجة عينات فردية وتنظيف المعدات بين الاستخدامات. | مقتطفات الخلية الكاملة من ثقافة الخميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع. | 2 |
| التحلل التلقائي، مطحنة الخرز | درجة حُكّة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة / Ø 0.5 مم، 5 × 3 دقائق/3 دقيقة | سريعة وفعالة تحلل، وخاصة بالنسبة لإعداد استخراج على نطاق صغير | يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات الضرب حبة المطلوبة. | تحليلات صغيرة الحجم. | 10 |
| التحلل التلقائي، سونيكيشن | درجة الحرارة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة، 4 × 5 دقيقة/2 دقيقة، نبض 80٪، قوة 80٪ | معدات سونيكيشن عادة ما تكون متاحة في معظم المؤسسات. | يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات سونيكيشن المطلوبة. يمكن أن يستغرق التحلل البطيء أكثر من 24 ساعة. | الخميرة خلية الجدار الاستعدادات. | |
| عملية الغليان والتجميد | لا توجد معدات متخصصة تحتاج سوى الفريزر القياسية وكتلة التدفئة أو حمام الماء الساخن. | كفاءة، قابلة للاستنساخ، بسيطة وغير مكلفة. | يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. | تحليل الحمض النووي من قبل PCR. | 5 |
الجدول 1: مقارنة الأساليب المتاحة لإعداد مستخلصات الخميرة.
يستخدم التبريد (الملقب طحن المبردة / طحن المبردة) عادة لاسترداد الأحماض النووية والبروتينات أو المواد الكيميائية من عينات حساسة لدرجة الحرارة بطريقة موثوقة للتحليلات الكمية أو النوعية. وقد تم استخدامه بنجاح لتطبيقات متعددة في مجالات متنوعة بما في ذلك التكنولوجيا الحيوية، وعلم السموم، وعلم الطب الشرعي12،13، والعلوم البيئية، والبيولوجيا النباتية14 وعلوم الغذاء. عادة ما تعتمد عزل الجزيئات الحيوية البيولوجية السليمة بشكل حاسم على درجة الحرارة. تضمن درجات الحرارة المنخفضة للغاية بقاء البروتياز والنيات غير نشطة ، مما يؤدي إلى عزل موثوق به للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الأخرى للتحليلات اللاحقة. في الواقع، يحافظ مطحنة الفريزر عادة على درجة حرارة العينة من -196 درجة مئوية (نقطة غليان LN2)، وبالتالي تقليل الحمض النووي/الحمض النووي الريبي أو التآكل البروتيني والتحلل.
طاحونة الفريزر توظف غرفة طحن الكهرومغناطيسية التي تتحرك بسرعة شريط معدني صلب أو اسطوانة ذهابا وإيابا داخل قارورة تحتوي على عينة ليتم سحقها بين سدادات نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ. الأداة يخلق وعكس بسرعة حقل مغناطيسي داخل غرفة طحن. كما يتحول المجال المغناطيسي ذهابا وإيابا، والمغناطيس يسحق العينة ضد المقابس وبالتالي تحقيق ‘cryogrinding’ والسحق من الفشار. تحل طاحونة الفريزر محل الملاط و المهاترات وتسمح بالتجهيـز التسلسلي لعينات متعددة (أو ما يصل إلى 4 عينات أصغر في نفس الوقت) مع قابلية عالية للتكرار وتتجنب التقلبات من المستخدم إلى المستخدم المرتبطة بالطحن اليدوي. بمجرد معالجة العينات، يمكن استخدام مستخلصات الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات المتلقية للمعلومات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك قيد من دراسة البروتينات المحلية من الخميرة هو تحلل غير فعال من خلايا الخميرة بسبب جدار الخلايا صعبة. على الرغم من أن عدة طرق قد وضعت، الأسلوب الأكثر اتساقا وكفاءة في أيدينا هو cryogrinding من خلايا الخميرة فلاش المجمدة كما الفشار. هذه الطريقة تسمح لإعداد موثوق من مقتطفات الخلية كاملة عالي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم الأبحاث في مختبر غونجان بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم ووزارة الصحة في فلوريدا. نشكر الطالب الجامعي جون باركر على المساعدة التقنية.
Materials
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
- Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
- Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
- Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
- Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
- Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
- Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
- Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
- Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
- Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
- Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
- Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
- Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
- Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
- Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
- Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
- Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
- Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
- da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
- Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
- Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
- Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).
