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Immunologie et infection

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l’esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all’interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (SNC) è composto dal cervello e dal midollo spinale ed è avvolto dalle meningi, strati membranosi che fungono da barriera tra la periferia e il SNC. Il sistema nervoso centrale è un sito immunologicamente specializzato e, in condizioni di stato stazionario, il privilegio immunitario è più evidente nel parenchima del sistema nervoso centrale. Al contrario, le meningi ospitano una vasta gamma di cellule residenti, comprese le cellule immunitarie innate e adattative. Durante le condizioni infiammatorie innescate da lesioni del sistema nervoso centrale, autoimmunità, infezioni o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica possono entrare nel parenchima e risiedere all’interno delle meningi. Si ritiene che queste cellule svolgano azioni sia benefiche che dannose durante la patogenesi della malattia del SNC. Nonostante questa conoscenza, le meningi sono spesso trascurate quando si analizza il compartimento del SNC, perché i metodi convenzionali di estrazione del tessuto del SNC omettono gli strati meningei. Questo protocollo presenta due metodi distinti per l’isolamento rapido dei tessuti murini del SNC (cioè cervello, midollo spinale e meningi) che sono adatti per l’analisi a valle tramite tecniche a singola cellula, immunoistochimica e metodi di ibridazione in situ. I metodi descritti forniscono un’analisi completa dei tessuti del SNC, ideale per valutare il fenotipo, la funzione e la localizzazione delle cellule che occupano il compartimento del SNC in condizioni omeostatiche e durante la patogenesi della malattia.

Introduction

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche 2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, sono componenti cruciali del compartimento del SNC, partecipando attivamente alla sorveglianza immunitaria omeostatica e ai processi infiammatori durante la patogenesi della malattia 3,6,7,8. In condizioni di stato stazionario, le meningi supportano numerose cellule sentinella immunitarie, tra cui le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), i mastociti, le cellule T e, in misura minore, le cellule B 9,10,11.

Le meningi sono strutture altamente vascolarizzate e contengono vasi linfatici che forniscono una connessione linfatica tra il SNC e la sua periferia 8,12,13,14. Nelle condizioni infiammatorie indotte da lesioni del sistema nervoso centrale, infezioni, autoimmunità o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica si infiltrano nel parenchima e alterano il paesaggio immunitario all’interno delle meningi. A seguito dell’infiltrazione cellulare, le meningi possono rappresentare una nicchia funzionale per le cellule immunitarie di derivazione periferica, promuovendo l’aggregazione delle cellule immunitarie, l’attivazione delle cellule immunitarie locali e la sopravvivenza a lungo termine nel compartimento del SNC. L’infiammazione meningea prominente si osserva in molteplici malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla (SM) 15,16,17,18,19, l’ictus 20,21, la lesione sterile 22,23 (cioè lesione del midollo spinale e lesione cerebrale traumatica), l’emicrania 24 e l’infezione microbica 25,26,27,28,29. Pertanto, la caratterizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie di derivazione periferica nel compartimento meningeo è essenziale per comprendere il ruolo di queste cellule durante le condizioni di stato stazionario e la patogenesi della malattia.

L’estrazione del cervello, del midollo spinale e delle meningi dal cranio e dai corpi vertebrali è tecnicamente impegnativa e richiede molto tempo. Attualmente non sono disponibili tecniche per l’estrazione rapida del cervello con tutti e tre gli strati meningei intatti. Sebbene la laminectomia produca un’eccellente morfologia del tessuto del midollo spinale e preservi gli strati meningei, è estremamente dispendiosa in termini di tempo e complicata30,31. Al contrario, i metodi di estrazione più convenzionali come la rimozione del cervello dal cranio e l’estrusione idraulica del midollo spinale facilitano la rapida estrazione del tessuto del SNC, ma sia le meningi aracnoidie che quelle durali vengono perse con queste tecniche30,31. L’omissione degli strati della dura e dell’aracnoide durante l’isolamento convenzionale dei tessuti cerebrali e del midollo spinale provoca un’analisi incompleta delle cellule all’interno del compartimento del SNC. Pertanto, l’identificazione di nuove tecniche focalizzate sull’estrazione rapida di tessuti del SNC con meningi intatte è fondamentale per l’analisi ottimale del compartimento del SNC.

Questo manoscritto presenta due metodi per l’estrazione rapida del cervello, del midollo spinale e delle meningi dai topi, facilitando l’analisi a valle delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente nel parenchima del SNC e nelle meningi. Questi protocolli ottimizzati si concentrano su 1) l’isolamento di sospensioni a singola cellula per l’analisi a valle e 2) la preparazione del tessuto per l’elaborazione istologica. L’ottenimento di sospensioni unicellulari dal cervello, dal tessuto del midollo spinale e dalle meningi durali e aracnoidee32 consente l’analisi simultanea delle cellule che risiedono sia nel compartimento parenchimale che in quello meningeo. Le sospensioni a singola cellula possono essere utilizzate in diverse applicazioni, tra cui saggi di coltura cellulare per eseguire la stimolazione in vitro 33, immunospot enzimatico (ELISpot)28,34,35, citometria a flusso36,33 e trascrittomica a singola cellula 37 o bulk. Inoltre, il protocollo ottimizzato per la decalcificazione di interi cervelli e midolli spinali con crani o colonne vertebrali intatti, rispettivamente, consente la decalcificazione delicata dell’osso circostante, lasciando intatte le meningi e preservando la morfologia dei tessuti. Questo metodo consente l’identificazione selettiva di proteine o RNA utilizzando tecniche di immunoistochimica (IHC) o ibridazione in situ (ISH) sia all’interno dello spazio parenchimale che meningeo. La caratterizzazione del fenotipo, dello stato di attivazione e della localizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente all’interno del SNC può fornire informazioni essenziali per comprendere come i singoli tipi di cellule nel compartimento del SNC contribuiscano all’omeostasi e alla patogenesi della malattia.

Protocol

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Geisel School of Medicine di Dartmouth. 1. Elaborazione di campioni di cervello e midollo spinale per la decalcificazione Isolamento di campioni di cervello e midollo spinale Eutanasia il topo tramite inalazione di CO2 . Assicurarsi che la portata di CO2 sposti il 10%-30% del volume della gabbia al m…

Representative Results

Questo esperimento rappresentativo aveva lo scopo di quantificare le cellule B e T e descrivere la localizzazione delle cellule B e T nei compartimenti meningeo e parenchimale del SNC in condizioni omeostatiche e in un modello murino di SM progressiva (i.e., TMEV-IDD). TMEV-IDD è stato indotto in topi SJL femmine di 5 settimane da infezione intracranica con 5 x 106 unità formanti placca (PFU) di TMEV BeAn come descrittoin precedenza 29. Il presente studio h…

Discussion

I metodi per valutare la composizione cellulare nel compartimento del SNC durante l’omeostasi e la malattia sono essenziali per comprendere gli stati fisiologici e patologici del SNC. Tuttavia, nonostante fungano da importante barriera nel sistema nervoso centrale e ospitino una vasta gamma di cellule immunitarie, le meningi sono spesso omesse dall’analisi perché molti metodi convenzionali di estrazione dei tessuti per il cervello e il midollo spinale non consentono la raccolta di queste membrane. Questa omissione è un…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la loro cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Bornstein Research Fund ha finanziato questa ricerca.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
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