Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Summary

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.

Abstract

Combater patologias neurodegenerativas humanas e gerenciar seu impacto socioeconômico generalizado está se tornando uma prioridade global. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade de vida humana e o sistema de saúde, a maioria dos distúrbios neurodegenerativos humanos ainda permanece incurável e inde prevenivel. Portanto, o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra tais males está se tornando uma urgência premente. A deterioração dos circuitos e funções neuronais associadas à idade é evolutivamente conservada em organismos tão diversos quanto o humilde verme Caenorhabditis elegans e humanos, significando semelhanças nos mecanismos celulares e moleculares subjacentes. C. elegans é um modelo genético altamente maleável, que oferece um sistema nervoso bem caracterizado, transparência corporal e um repertório diversificado de técnicas genéticas e de imagem para avaliar a atividade neuronal e o controle de qualidade durante o envelhecimento. Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íons hiperativado (por exemplo, deg-3(d) e mec-4(d)) e agregado de proteínas (por exemplo, neurotoxina α-syuncleina e poli-glutamato)-induzidas por neurotoxicidade, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de quebra neuronal relacionada à idade. Uma combinação desses modelos de neurodegeneração animal, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular, levará a uma compreensão sem precedentes da discriminação relacionada à idade da função neuronal e fornecerá insights críticos com ampla relevância para a saúde humana e qualidade de vida.

Introduction

Nas últimas duas décadas, C. elegans tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo para investigar os mecanismos moleculares da morte celular necrótica. C. elegans oferece um sistema nervoso excepcionalmente bem caracterizado e mapeado, estrutura corporal transparente e um repertório diversificado de métodos genéticos e de imagem para monitorar a função celular in vivo e a sobrevivência ao longo do envelhecimento. Assim, vários modelos genéticos C. elegans de neurodegeneração já foram desenvolvidos para avaliar a viabilidade neuronal. Em particular, os modelos de nematoides bem descritos e utilizados incluem a necrose hiperativa induzida pelo canal^{de íons 1,,2,3} e morte celular desencadeada pelo aumento da agregação proteica^{4,,5,,6,,7,,8,,9,,10} e insolação^11,,12,entre outros.

A exposição a curto prazo a temperaturas sub-letais conferiu resistência à morte celular necrosada, desencadeada por um estresse térmico subsequente tanto em nematoides quanto em neurônios mamíferos¹¹. Curiosamente, o pré-condicionamento diário de nematoides a uma temperatura elevada leve protege contra a neurodegeneração, que é infligida por diversos estímulos, como desequilíbrio iônico (por exemplo, mec-4(u231) e/ou deg-3(u662)) e agregação de proteínas (por exemplo, α-sinucleína e polyQ40)^11,13.

Aqui, descrevemos metodologias versáteis usando C. elegans para monitorar e avaliar a neurodegeneração dependente da idade em modelos bem estabelecidos de doenças humanas, como morte celular desencadeada por excitotoxicidade, Parkinson e doença de Huntington. Além disso, sublinhamos o papel neuroprotetor do pré-condicionamento térmico em vários modelos de neurodegeneração. Uma combinação dessas técnicas em conjunto com telas genéticas e/ou farmacológicas resultará na identificação e caracterização de novos moduladores de morte celular, com potencial interesse terapêutico.

Protocol

1. Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos NOTA: Mutações de ganho de função na família genética de degenerinas, incluindo mec-4 e deg-3, entre outras, resultam na geração de canais de íons hiperativos desencadeando a morte celular necrosada de seis neurônios receptores de toque necessários para mecanosensação em vermes3. A necrose induzida pela estimulação aberrante das degenerinas apresenta várias semelhanças mecanic…

Representative Results

Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativosUtilizando os procedimentos aqui apresentados, os embriões mutantes mec-4(u231) e deg-3u662 foram incubados por 25 min a 34 °C ou mantidos na temperatura padrão de 20 °C. Ao eclodir, o número de corpos de células neuronais foi determinado no estágio larval L1 de ambos os grupos. A morte celular necrótica é diminuída em nematoides que eclodiram de ovos pré-condicionados de choque térmico(Figura…

Discussion

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis para crescimento, sincronização e exame microscópico de alguns modelos versáteis de C. elegans que investigam a neurodegeneração dependente da idade. Particularmente, avaliamos e dissecamos os fundamentos celulares e moleculares da quebra neuronal relacionada à idade, utilizando necrose hiperativada induzida pelo canal de íons e neurotoxicidade induzida por^{proteínas 1,,2,<…}

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)