Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans
Summary
Здесь мы вводим и описываем широко доступные методологии с использованием некоторых универсальных моделей нематод, включая гиперактивированный ионный канал индуцированного некрозания и белоковой нейротоксичности, для мониторинга и вскрытия клеточных и молекулярных основ возрастных нейродегенеративных заболеваний.
Abstract
Борьба с нейродегенеративными патологиями человека и управление их всепроникающим социально-экономическим воздействием становится глобальным приоритетом. Несмотря на их пагубное воздействие на качество жизни человека и систему здравоохранения, большинство нейродегенеративных расстройств человека по-прежнему остаются неизлечимыми и не предотвратимыми. Поэтому разработка новых терапевтических вмешательств против таких недугов становится актуальной. Возрастное ухудшение нейронных цепей и функций эволюционно сохраняется в организмах, столь же разнообразных, как скромный червь Caenorhabditis elegans и людей, означающих сходство в основных клеточных и молекулярных механизмов. C. elegans является очень податливой генетической моделью, которая предлагает хорошо охарактеризованную нервную систему, прозрачность тела и разнообразный репертуар генетических и визуальных методов для оценки нейронной активности и контроля качества во время старения. Здесь мы вводим и описываем методологии, используя некоторые универсальные модели нематод, в том числе гиперактивированный ионный ионный некроз (например, deg-3 (d) и mec-4 (d)) и белковый агрегат (например, протеиновый разбивка и поли-глутамат) Сочетание этих моделей нейродегенерации животных, а также генетические и фармакологические экраны для модуляторов смерти клеток приведет к беспрецедентному пониманию возрастного распада нейронов и обеспечит критическое понимание с широким значением для здоровья человека и качества жизни.
Introduction
За последние два десятилетия C. elegans широко использовался в качестве модельного организма для исследования молекулярных механизмов смерти некротических клеток. C. elegans предлагает исключительно хорошо охарактеризованную и отображенную нервную систему, прозрачную структуру тела и разнообразный репертуар генетических и визуальных методов для мониторинга клеточной функции in vivo и выживания на протяжении всего старения. Таким образом, несколько C. elegans генетические модели нейродегенерации уже были разработаны для оценки жизнеспособности нейронов. В частности, хорошо описанные и используемые модели нематод включают гиперактивный ионный канал индуцированного некрозания1,,2,3 и гибель клеток, вызванную повышенной агрегацией белка,4,5,6,7,8,,9,,10 и тепловой удар11,12, среди других.
Краткосрочное воздействие сублетальных температур придавало сопротивление против смерти некротических клеток, вызванное последующим тепловым стрессом как в нематодах, так и в нейронах млекопитающих11. Интересно, что ежедневное предурочича нематод при мягкой повышенной температуре защищает от нейродегенерации, которая наносится различными стимулами, такими как ионный дисбаланс (например, mec-4 (u231) и/или deg-3 (u662)) и агрегация белка (например,,1311-
Здесь мы описываем универсальные методологии с использованием C. elegans для мониторинга и оценки возрастной нейродегенерации в устоявшихся моделях заболеваний человека, таких как эксцитотоксичность с вызванной гибелью клеток, болезнь Паркинсона и Гентингтона. Кроме того, мы подчеркиваем нейропротекторную роль тепловых предпосылок в нескольких моделях нейродегенерации. Сочетание этих методов вместе с генетическими и / или фармакологических экранов приведет к выявлению и характеристике новых модуляторов смерти клеток, с потенциальным терапевтическим интересом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы вводим и описываем широко доступные методологии роста, синхронизации и микроскопического исследования некоторых универсальных моделей C. elegans, исследующих возрастную нейродегенерацию. В частности, мы оцениваем и вскрываем клеточные и молекулярные основы возрастного нер…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Chaniotakis M. и Kounakis K. за видеозапись и редактирование. K.P. финансируется за счет гранта Греческого фонда исследований и инноваций (HFRI) и Генерального секретариата по исследованиям и технологиям (GSRT). N.T. финансируется за счет грантов Европейского исследовательского совета (ERC – GA695190 – MANNA), Рамочных программ Европейской комиссии и Министерства образования Греции.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson’s disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
