Modellering Åldersassocierade neurodegenerativa sjukdomar i Caenorhabditis elegans
Summary
Här introducerar och beskriver vi allmänt tillgängliga metoder som använder några mångsidiga nematodmodeller, inklusive hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros och proteinaggregerad neurotoxicitet, för att övervaka och dissekera de cellulära och molekylära underbyggnaderna av ålderssasocierade neurodegenerativa sjukdomar.
Abstract
Att bekämpa mänskliga neurodegenerativa patologier och hantera deras genomgripande socioekonomiska effekter håller på att bli en global prioritet. Trots deras skadliga effekter på människors livskvalitet och hälso- och sjukvårdssystemet är majoriteten av de mänskliga neurodegenerativa sjukdomarna fortfarande obotliga och kan inte förebyggas. Därför blir utvecklingen av nya terapeutiska interventioner mot sådana sjukdomar en brådskande brådska. Åldersassocierad försämring av neuronala kretsar och funktion är evolutionärt bevaras i organismer så olika som den ringa masken Caenorhabditis elegans och människor, vilket innebär likheter i de underliggande cellulära och molekylära mekanismer. C. elegans är en mycket formbar genetisk modell, som erbjuder ett väl karakteriserat nervsystem, kroppstransparens och en mångsidig repertoar av genetiska och bildframställningstekniker för att bedöma neuronal aktivitet och kvalitetskontroll under åldrandet. Här introducerar och beskriver vi metoder som använder några mångsidiga nematodmodeller, inklusive hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros (t.ex. deg-3(d) och mec-4(d)) och proteinaggregat (t.ex. α-syunclein och polyglutamat)-inducerad neurotoxicitet, för att övervaka och dissekera den cellulära och cellulära underbyggnad av åldersrelaterad neuronal nedbrytning. En kombination av dessa djurneurindegenerationsmodeller, tillsammans med genetiska och farmakologiska skärmar för celldödsmodulatorer, kommer att leda till en aldrig tidigare skådad förståelse av åldersrelaterad nedbrytning av neuronal funktion och kommer att ge kritiska insikter med bred relevans för människors hälsa och livskvalitet.
Introduction
Under de senaste två decennierna har C. elegans använts i stor utsträckning som en modell organism för att undersöka de molekylära mekanismerna för nekrotisk celldöd. C. elegans erbjuder ett exceptionellt väl karakteriserat och kartlagt nervsystem, transparent kroppsstruktur och en mångsidig repertoar av genetiska metoder och avbildningsmetoder för att övervaka in vivo cellulär funktion och överlevnad under hela åldrandet. Således har flera C. elegans genetiska modeller av neurodegeneration redan utvecklats för att bedöma neuronal lönsamhet. I synnerhet, väl beskrivna och används nematod modeller inkluderar hyperaktiv jon kanal-inducerad nekros1,2,3 och celldöd utlöses av ökad protein aggregering4,5,6,77,8,9,10 och värmeslag11,12, bland andra.
Kortvarig exponering för sub-dödliga temperaturer gav resistens mot nekrotisk celldöd, utlöses av en efterföljande värmestress både i nematoder och däggdjursneuron11. Intressant, daglig förkonditionering av nematoder vid en mild förhöjd temperatur skyddar mot neurodegeneration, som orsakas av olika stimuli, såsom jonisk obalans (t.ex. mec-4(u231) och/eller deg-3(u662)) och proteinaggregering (t.ex. α-synuclein och polyQ40)11,13.
Här beskriver vi mångsidiga metoder som använder C. elegans för att övervaka och utvärdera åldersberoende neurodegeneration i väletablerade modeller av mänskliga sjukdomar, såsom excitotoxicitet-utlöst celldöd, Parkinsons och Huntingtons sjukdom. Dessutom understryker vi den nervskyddande roll värmekonditionering i flera modeller av neurodegeneration. En kombination av dessa tekniker tillsammans med genetiska och/eller farmakologiska skärmar kommer att resultera i identifiering och karakterisering av nya celldödsmodulatorer, med potentiellt terapeutiskt intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar och beskriver vi allmänt tillgängliga metoder för tillväxt, synkronisering och mikroskopisk undersökning av några mångsidiga C. elegans-modeller som undersöker åldersberoende neurodegeneration. Särskilt bedömer och dissekerar vi de cellulära och molekylära underbyggnaderna av åldersrelaterad neuronal nedbrytning genom att använda hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros och proteinaggregatinducerad neurotoxicitet1,2,<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Chaniotakis M. och Kounakis K. för videoinspelning och redigering. K.P. finansieras genom ett bidrag från Hellenic Foundation for Research and Innovation (HFRI) och Generalsekretariatet för forskning och teknik (GSRT). N.T. finansieras genom bidrag från Europeiska forskningsrådet (ERC – GA695190 – MANNA), Europeiska kommissionens ramprogram och det grekiska utbildningsministeriet.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson’s disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
