Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi
Summary
Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.
Abstract
İnsan nörodejeneratif patolojileri ile mücadele ve yaygın sosyoekonomik etkileri yönetmek küresel bir öncelik haline gelmektedir. İnsan yaşam kalitesi ve sağlık sistemi üzerindeki zararlı etkilerine rağmen, insan nörodejeneratif bozuklukların çoğunluğu hala tedavi edilemez ve engellenemez kalır. Bu nedenle, bu tür hastalıklara karşı yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi acil bir aciliyet haline gelmektedir. Nöronal devrelerin ve fonksiyonun yaşla ilişkili bozulması, düşük solucan Caenorhabditis elegans ve insanlar gibi çeşitli organizmalarda evrimsel olarak korunur ve altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalarda benzerlikleri belirtir. C. elegans, yaşlanma sırasında nöronal aktivite ve kalite kontrolünü değerlendirmek için iyi karakterize bir sinir sistemi, vücut şeffaflığı ve genetik ve görüntüleme tekniklerinin çeşitli repertoire’sini sunan son derece biçimlendirilebilir bir genetik modeldir. Burada, hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz (örneğin, deg-3(d) ve mec-4(d)ve protein agregası (örn. α-syunclein ve poli-glutamat) kaynaklı nörotoksisite, yaşla ilgili nöronsal inancının hücresel ve moleküler alt çökmelerini izlemek ve incelemek gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz. Bu hayvan nörodejenerasyon modellerinin bir kombinasyonu, hücre ölümü modülatörleri için genetik ve farmakolojik ekranlar ile birlikte nöronal fonksiyonun yaşa bağlı arıza benzeri görülmemiş bir anlayış yol açacaktır ve insan sağlığı ve yaşam kalitesi için geniş alaka ile kritik anlayışlar sağlayacaktır.
Introduction
Son yirmi yılda, C. elegans yaygın nekrotik hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model organizma olarak kullanılmıştır. C. elegans son derece iyi karakterize ve eşlenmiş sinir sistemi, şeffaf vücut yapısı ve genetik ve görüntüleme yöntemleri nin çeşitli repertoire in vivo hücresel fonksiyon ve yaşlanma boyunca sağkalım izlemek için sunuyor. Böylece, nörodejenerasyon çeşitli C. elegans genetik modelleri zaten nöronal canlılık değerlendirmek için geliştirilmiştir. Özellikle, iyi tanımlanmış ve kullanılan nematod modelleri hiperaktif iyon kanal kaynaklı nekroziçerir 1,2,3 ve hücre ölümü artan protein toplama tarafından tetiklenen4,5,,6,,7,99,10 ve sıcak çarpması11,12, diğerleri arasında.
Nematodlarda ve memeli nöronlarında sonraki bir ısı stresinin tetiklediği nekrotik hücre ölümüne karşı direnç kazandırAn alt öldürücü sıcaklıklara kısa süreli maruz kalma11. İlginçtir ki, nematodların hafif yüksek sıcaklıkta günlük ön koşullandırması, iyonik dengesizlik (örn. mec-4(u231) ve/veya deg-3(u662)ve protein toplama (örn., α-synüklein ve poliQ40)11,13gibi çeşitli uyaranların neden olduğu nörodejenerasyona karşı korur.
Burada, excitotoksisite tetikli hücre ölümü, Parkinson ve Huntington hastalığı gibi insan hastalıklarının köklü modellerinde yaşa bağlı nörodejenerasyonu izlemek ve değerlendirmek için C. elegans kullanarak çok yönlü metodolojileri tanımlıyoruz. Ayrıca, nörodejenerasyon çeşitli modellerde ısı önkoşullanma nöroprotektif rolü altını çizer. Bu tekniklerin genetik ve/veya farmakolojik ekranlarla bir leşi sonucu, yeni hücre ölümü modülatörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu potansiyel terapötik ilgi ile sonuçlanacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, yaşa bağlı nörodejenerasyonu araştıran çok yönlü C. elegans modellerinin büyüme, senkronizasyon ve mikroskobik incelemesi için yaygın olarak erişilebilir metodolojiler sokulmaktadır. Özellikle, biz değerlendirmek ve hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite1,2,,3,,4,5,<sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chaniotakis M. ve Kounakis K.’ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği’nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı’nın bağışları ile finanse edilmektedir.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson’s disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
