Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili utilizzando alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ionica indotta dal canale ionico e la neurotossicità indotta da aggregazioni proteiche, per monitorare e sezionare le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative associate all’età.
Combattere le patologie neurodegenerative umane e gestire il loro impatto socioeconomico pervasivo sta diventando una priorità globale. Nonostante i loro effetti nocivi sulla qualità della vita umana e sul sistema sanitario, la maggior parte dei disturbi neurodegenerativi umani rimangono ancora incurabili e non prevenibili. Pertanto, lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro tali malattie sta diventando un’urgenza urgente. Il deterioramento associato all’età dei circuiti neuronali e della funzione è evolutivamente conservato in organismi diversi come il verme umile Caenorhabditis elegans e gli esseri umani, che significa somiglianze nei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. C. elegans è un modello genetico altamente malleabile, che offre un sistema nervoso ben caratterizzato, trasparenza del corpo e un repertorio diversificato di tecniche genetiche e di imaging per valutare l’attività neuronale e il controllo della qualità durante l’invecchiamento. Qui, introduciamo e descriviamo metodologie che utilizzano alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ioonizzata indotta dal canale ionico (ad esempio, deg-3(d) e mec-4(d)) e l’aggregazione proteica (ad esempio, la siccoliera e la neurotossicisia indotta dalla poli-glutamata) per sezionare e sezionare le basi cellulari e molecolari. Una combinazione di questi modelli di neurodegenerazione animale, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare porterà a una comprensione senza precedenti della ripartizione della funzione neuronale legata all’età e fornirà informazioni critiche con ampia rilevanza per la salute umana e la qualità della vita.
Negli ultimi due decenni, C. elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i meccanismi molecolari della morte cellulare necrotica. C. elegans offre un sistema nervoso eccezionalmente ben caratterizzato e mappato, una struttura del corpo trasparente e un repertorio diversificato di metodi genetici e di imaging per monitorare la funzione cellulare in vivo e la sopravvivenza durante l’invecchiamento. Così, diversi modelli genetici C. elegans di neurodegenerazione sono già stati sviluppati per valutare la vitalità neuronale. In particolare, i modelli di nematode ben descritti e utilizzati includono la necrosi ioattiva indotta dal canale ionico1,2,3 e la morte cellulare innescata da una maggiore aggregazione proteica4,5,6,7,8,9,10 e colpo di calore11,12, tra gli altri.
L’esposizione a breve termine a temperature subletali ha conferito resistenza contro la morte delle cellule necrotiche, innescata da un successivo stress termico sia nei nematodi che nei neuroni mammiferi11. È interessante notare che il precondizionamento giornaliero dei nematodi a una temperatura elevata lieve protegge dalla neurodegenerazione, che viene inflitta da diversi stimoli, come lo squilibrio ionico (ad esempio, il mec-4(u231) e/o il deg-3 (u662)) e l’aggregazione delle proteine (ad esempio, zo-sinucleina e poliQ40)11,13.
Qui, descriviamo metodologie versatili usando C. elegans per monitorare e valutare la neurodegenerazione dipendente dall’età in modelli consolidati di malattie umane, come la morte cellulare innescata da eccitotossicità, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington. Inoltre, sottolineiamo il ruolo neuroprotettivo del precondizionamento del calore in diversi modelli di neurodegenerazione. Una combinazione di queste tecniche con schermi genetici e/o farmacologici comporterà l’identificazione e la caratterizzazione di nuovi modulatori di morte cellulare, con potenziale interesse terapeutico.
Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili per la crescita, la sincronizzazione e l’esame microscopico di alcuni modelli versatili di C. elegans che studiano la neurodegenerazione dipendente dall’età. In particolare, valutiamo e seleviamo le basi cellulari e molecolari della ripartizione neuronale legata all’età utilizzando necrosi ionica indotta dal canale iperattivato e neurotossicità indotta da proteine1,2,<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione video e l’editing. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l’innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziata da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell’istruzione.
Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
Phosphate buffer | |||
Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |