In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation
Summary
Hier wird ein Protokoll zur genetischen Manipulation im embryonalen Frettchenhirn unter Verwendung der Utero-Elektroporation vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Ausrichtung von neuronalen Vorläuferzellen im Neocortex in vivo.
Abstract
Die Manipulation der Genexpression in vivo während der embryonalen Entwicklung ist die Methode der Wahl bei der Analyse der Rolle einzelner Gene während der Entwicklung von Säugetieren. In der Gebärmutterelektroporation ist eine Schlüsseltechnik für die Manipulation der Genexpression im embryonalen Säugetiergehirn in vivo. Ein Protokoll zur In-Utero-Elektroporation des embryonalen Neocortex von Frettchen, einem kleinen Fleischfresser, wird hier vorgestellt. Das Frettchen wird zunehmend als Modell für die Neocortex-Entwicklung verwendet, weil sein Neocortex eine Reihe anatomischer, histologischer, zellulärer und molekularer Merkmale aufweist, die auch bei menschlichen und nichtmenschlichen Primaten vorhanden sind, aber in Nagetiermodellen wie Maus oder Ratte fehlen. Bei der Utero-Elektroporation wurde am embryonalen Tag (E) 33, einem Midneurogenese-Stadium bei Frettchen, durchgeführt. In der Gebärmutter-Elektroporation zielt auf neuronale Vorläuferzellen, die die lateralen Ventrikel des Gehirns auskleiden. Während der Neurogenese, Diese Vorläuferzellen geben alle anderen neuronalen Zelltypen. Diese Arbeit zeigt repräsentative Ergebnisse und Analysen bei E37, Postnataltag (P) 1 und P16, entsprechend 4, 9 und 24 Tagen nach der Utero-Elektroporation. In früheren Stadien besteht die Nachkommenschaft der Zielzellen hauptsächlich aus verschiedenen neuronalen Vorläufersubtypen, während in späteren Stadien die meisten markierten Zellen postmitotische Neuronen sind. So ermöglicht die in der Utero-Elektroporation die Untersuchung der Wirkung genetischer Manipulation auf die zellulären und molekularen Merkmale verschiedener Arten von Nervenzellen. Durch seine Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen, in der Utero Elektroporation kann auch für die Manipulation von histologischen und anatomischen Merkmalen des Frettchen neocortex verwendet werden. Wichtig ist, dass alle diese Effekte akut sind und mit einer vom Benutzer bestimmten spatiotemporalen Spezifität durchgeführt werden.
Introduction
Der Neocortex ist das äußere Blatt des Säugetier-Großhirns und der Sitz der höheren kognitiven Funktionen1,2,3,4,5. Um eine akute genetische Manipulation des Säugetierneocortex in vivo während der embryonalen Entwicklung zu erreichen, wurden zwei verschiedene Methoden untersucht: Virusinfektion6 und utero Elektroporation7. Beide Methoden ermöglichen eine effiziente Ausrichtung auf neokortikale Zellen, leiden aber unter einigen Einschränkungen. Der hauptvorteil der Utero-Elektroporation im Vergleich zur Virusinfektion ist die Fähigkeit, räumliche Spezifität innerhalb des Neocortex zu erreichen, die durch die Regulierung der Richtung des elektrischen Feldes erreicht wird.
Da die Elektroporation erstmals gezeigt wurde, um den Eintrag von DNA in die Zellen in vitro8zu erleichtern, wurde sie angewendet, um DNA in verschiedenen Wirbeltieren in vivo zu liefern. In der Entwicklungsneurowissenschaft wurde in der Utero-Elektroporation der Maus Neocortex erstmals 2001 berichtet9,10. Dieses Verfahren besteht aus einer Injektion des DNA-Gemischs in den seitlichen Ventrikel des embryonalen Gehirns und der anschließenden Anwendung des elektrischen Feldes mit Pinzettenelektroden, die räumliche Präzision7,11ermöglicht. In der Gebärmutter wurde seitdem die Elektroporation angewendet, um Nukleinsäuren zu liefern, um die Expression endogener oder ektopisch zugesetzter Gene im Mausneocortex zu manipulieren. Wichtige Fortschritte wurden in letzter Zeit durch die Anwendung der Methodik der CRISPR/Cas9-vermittelten Genombearbeitung über die Utero-Elektroporation im Maus-Neocortex erzielt, um (1) Genstörungen in postmitotischen Neuronen12,,13 und neuronalen Vorläuferzellen14und (2) Genom15 und Epigenom16-Bearbeitung durchzuführen.
Sehr bald nach dem ersten Bericht in der Maus wurde in der Utero-Elektroporation auf die embryonale Ratte Neocortex17,18angewendet. Nicht-Nagetiere blieben eine Herausforderung, bis die erste in der Utero Elektroporation von Frettchen, ein kleiner Fleischfresser, wurde im Jahr 2012 gemeldet19,20. Seitdem wurde in der Utero-Elektroporation von Frettchen die Mechanismen der Neocortex-Entwicklung untersucht, indem neuronale Vorläufer und Neuronen20,21,22,22,manipuliert die Expression endogener Gene, einschließlich der Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie24, und durch die Bereitstellung von ektopischen Genen21,22,25, einschließlich humanspezifischer Gene26. Darüber hinaus wurde bei der Utero-Elektroporation von Frettchen verwendet, um Merkmale der menschlichen Neocortex-Entwicklung unter pathologischen Bedingungen zu adressieren27,28.
Im Kontext der Neocortex-Entwicklung sind die Vorteile der Verwendung von Frettchen als Modellorganismus im Vergleich zu Mäusen darauf zurückzuführen, dass Frettchen eine Reihe von menschenähnlichen Merkmalen besser rekapitulieren. Auf anatomischer Ebene weisen Frettchen ein charakteristisches Muster der kortikalen Faltung auf, das auch bei menschenverachtenden und den meisten anderen Primaten vorhanden ist, bei Mäusen oder Rattenjedochvöllig abwesend ist 4,29,30,31. Auf histologischer Ebene weisen Frettchen zwei unterschiedliche subventrikuläre Keimzonen auf, die als innere und äußere subventrikuläre Zonen (ISVZ bzw. OSVZ)32,33bezeichnet werden, die durch die innere Faserschicht23getrennt sind. Diese Eigenschaften werden auch mit Primaten geteilt, einschließlich Menschen, aber nicht mit Mäusen34. Die ISVZ und OSVZ bei Frettchen und Menschen sind mit reichlich neuronalen Vorläuferzellen bevölkert, während die subventrikuläre Zone (SVZ) von Mäusen nur spärliche neuronale Vorläufer21,32,35,36enthält. Auf zellulärer Ebene weisen Frettchen einen hohen Anteil eines Subtyps von neuronalen Vorläufern auf, die als basaler oder äußerer radialer Glia (bRG bzw. oRG) bezeichnet werden und als entscheidend für die evolutionäre Ausdehnung des Säugetierneocortex34,37,38angesehen werden. bRG sind daher sehr reichlich in der fetalen menschlichen und embryonalen Frettchen Neocortex, aber sie sind sehr selten in der embryonalen Maus Neocortex35,36. Darüber hinaus zeigt Frettchen bRG eine morphologische Heterogenität ähnlich der menschlichen bRG, weit überlegen gegenüber Maus bRG21. Schließlich zeigt die Entwicklung von Frettchen-Neocortex auf molekularer Ebene Genexpressionsmuster, die denen des fetalen menschlichen Neocortex sehr ähnlich sind, von denen angenommen wird, dass sie die Entwicklung der kortikalen Faltung steuern, unter anderem39.
Die zellbiologischen und molekularen Eigenschaften von Frettchen bRG machen sie hoch proliferativ, ähnlich wie menschliche bRG. Dies führt zu einer erhöhten Produktion von Neuronen und der Entwicklung eines erweiterten und hochkomplexen Neocortex34. Diese Eigenschaften machen Frettchen ausgezeichnete Modellorganismen für die Untersuchung von menschenähnlichen Merkmalen der Neocortex-Entwicklung, die nicht in Mäusen modelliert werden können26,40. Um das Frettchen als Modellorganismus voll auszunutzen, wurde die vorgestellte Methode entwickelt. Es besteht aus der Utero-Elektroporation von E33-Ferret-Embryonen mit einem Plasmid, das GFP (pGFP) unter der Kontrolle eines allgegenwärtigen Promotors, CAG, exzessiv ausdrückt. Die elektroporated Embryonen können dann embryonal oder postnatal analysiert werden. Um die Anzahl der geopferten Tiere zu reduzieren, werden weibliche Frettchen (Jills) durch Hysterektomie sterilisiert und zur Adoption als Haustiere gespendet. Wenn die gezielten Embryonen in embryonalen Stadien geerntet werden, wird eine zweite Operation durchgeführt und die Embryonen werden durch einen Kaiserschnitt entfernt, während die Jills hysterektomisiert sind. Wenn die gezielten Embryonen in postnatalen Stadien analysiert werden, werden die Jills hysterektomisiert, nachdem die Welpen entwöhnt oder geopfert wurden. Daher wird auch ein Protokoll für die Hysterektomie von Jills vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Utero-Elektroporation in Frettchen ist eine wichtige Technik, mit Vor- und Nachteilen gegenüber anderen Methoden. Es gibt wichtige Schritte und Einschränkungen für diese Methode, sowie mögliche Änderungen und zukünftige Anwendungen zu beachten.
Seit der Pionierarbeit von Victor Borrell und Kollegen zur genetischen Manipulation des postnatalen Frettchenneocortex mittels Elektroporation oder Virusinjektion35,42,<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Dienstleistungen und Einrichtungen des Max-Planck-Instituts für Molekulare Zellbiologie und Genetik für die hervorragende Unterstützung, insbesondere dem gesamten Team des Biomedizinischen Dienstes (BMS) für die hervorragende Frettchenhaltung und J. Peychl und seinem Team der Lichtmikroskopieanlage. Besonders dankbar sind wir Katrin Reppe und Anna Pfeffer vom BMS für die außergewöhnliche tierärztliche Unterstützung und Lei Xing von der Huttner-Gruppe für die Unterstützung bei Frettchenoperationen.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
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