Blokering Lymfeknuder Flow ved suturering afferent lymfekar i mus
Summary
En protokol til at blokere lymfeflow ved kirurgisk sutur af afferent lymfekar præsenteres.
Abstract
Lymfekar er afgørende for at opretholde vævsvæskebalancen og optimere immunbeskyttelsen ved at transportere antigener, cytokiner og celler til dræning af lymfeknuder (LNs). Afbrydelse af lymfeflow er en vigtig metode, når man studerer funktionen af lymfekar. De afferente lymfekar fra murine footpad til popliteal lymfeknuder (pLNs) er veldefineret som de eneste ruter for lymfedrænage i pLNs. Suturing disse afferente lymfekar kan selektivt forhindre lymfeknuder flow til pLNs. Denne metode giver mulighed for interferens i lymfeknuder flow med minimal skade på lymfe endotelceller i dræning pLN, den afferente lymfekar, samt andre lymfekar omkring området. Denne metode er blevet brugt til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker høje endotel venler (HEV) og chemokine udtryk i LN, og hvordan lymfe strømmer gennem fedtvæv omkring LN i mangel af funktionelle lymfekar. Med den voksende anerkendelse af betydningen af lymfefunktion, vil denne metode har bredere anvendelser for yderligere at optrævle funktionen af lymfekar i reguleringen af LN mikromiljø og immunrespons.
Introduction
Den rumlige organisering af lymfesystemet giver strukturel og funktionel støtte til effektivt at fjerne ekstracellulær væske og transportere antigener og antigen-præsenterende celler (APC’er) til de drænende LN’er. De første lymfekar (også kaldet lymfekapiller) er meget gennemtrængelige på grund af deres diskontinuerlige intercellulære vejkryds, som letter den effektive indsamling af væsker, celler og andre materialer fra omkringliggende ekstracellulære rum1. De første lymfekar fusionere i indsamling lymfekar, som har stramme intercellulære kryds, en kontinuerlig kælder membran, og lymfemuskel dækning. Indsamling lymfekar er ansvarlige for transport af indsamlede lymfeknuder til drænende LNs og i sidste ende vender tilbagelymfeknuder til omsætning 2,3. Indsamling lymfekar, der driver lymfeknuder ind i dræning LN er afferent lymfekar4,5,6,7. Obstruktion af afferente lymfekar kan blokere lymfestrømmen ind i LNs, hvilket er en nyttig teknik, når man studerer funktionen af lymfeknuder flow.
Tidligere undersøgelser har vist, at lymfeknuder flow spiller en væsentlig rolle i transport af antigener og APC’er, samt opretholde LN homøostase. Det er velkendt, at vævsbaserede APC’er, typisk aktiverede migrerende dendritiske celler (DCs), rejser gennem de affebende lymfekar til LN for at aktivere T-celler8. Tanken om, at frit-form antigener, såsom mikrober eller opløselige antigener, passivt flow med lymfeknuder til LN at aktivere LN-hjemmehørende APC’er har vundet accept i det seneste årti9,10,11,12. Free-form antigener rejser med lymfeknuder tage minutter efter infektionen til at rejse til LN, og LN-hjemmehørende celle aktivering kan forekomme inden for 20 min efter stimulation. Dette er meget hurtigere end aktivering af migrerende DC’er, som tager mere end 8 timer at komme ind i dræning LN9. Ud over at transportere antigener til at indlede immunbeskyttelse, lymfeknuder også bærer cytokiner og DC’er til LN at opretholde sin mikromiljø, og til at støtte immuncelle homøostase13,14. Tidligere viste blokering af lymfeknuder ved at suturere de afferente lymfekar, at lymfeknuder er nødvendige for at opretholde den HEV-fænotype, der kræves til støtte for homøostatisk T-celle og B-celle, derhovertil LN 15,16,17. CCL21 er en kritisk chemokine, der dirigerer DC og T celle positionering i LN8,18. Blokering af lymfeflow afbryder CCL21-udtrykket i LN og afbryder potentielt placeringen af DC- og T-celler og/eller interaktionen i LN19. Således, blokering lymfeknuder flow kan direkte eller indirekte ophæve antigen / DC adgang til dræning LN ved at forstyrre LN mikromiljø, der regulerer immunrespons i LN. For bedre at undersøge funktionen af lymfeflow præsenteres en eksperimentel protokol (Figur 1) for at blokere lymfestrømmen hos mus ved at suturere de afferente lymfekar fra fodpladen til pLN. Denne metode kan være en vigtig teknik til fremtidige undersøgelser af lymfefunktion i sunde og syge tilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blokering lymfeknuder flow vil have brede anvendelser i at manipulere antigen levering til LN i sunde og syge betingelser. Det er muligt at bruge denne metode til at kontrollere timingen af antigen levering for at undersøge, hvordan kontinuerlig lymfeknuder flow regulerer immunrespons i dræning LNs. Denne metode til afbrydelse af lymfeflowet kan også bruges til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker celleopdeling, celleaktivering, cellemigration og cellecelleinteraktioner i LN.
Mus, d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Ava Zardynez for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde støttes af Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) og Canada Foundation for Innovation for SL (32930) og af National Natural Science Foundation of China for Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
